Способ дифференциации грибов. и. от других дрожжеподобных грибов

СОЮЗ СОВЕТСКИХссаилю 1/четиРЕСПУБЛИН 091 (И) 2 И 1 16 Й НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Бюл. Вовдена Тльскох удового Красзяйственный 3(088.8)ов Е.В. Профиллеваний с/х жи1978, т. 13,ика тных.ыпа Зу Е. ов Фе ода нС -7 ментативная СапйЫа. И, 1980 у (прототип). с. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ АВТОРСКОМУ( СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Донской оного Знамени синститут(56) 1. Себряки лечение забоСборник ДонСХИс.30"36.2. СеГряковактивность гриСбнаучитрудт. 15, вып. 2,(54)(57) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГРИБОВ С,А 1.В 1 САМЯ И С,ТКОР 1 САЫБ ОТ ДРУГИХ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ, включающий выращивание культуры грибовв течение 20-24 ч в среде, содержа.щей сыворотку крови и лактозу,определение морфологических особенностейкультуры гриба, добавление индикатора и регистрацию изменения цветакультуральной жидкости, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения эффективности способа,в качестве. индикатора используют метиловый красный, а перед добавлениеминдикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в течение4-6 ч в среде, содержащей сахарозуи резазурин, а в качестве показателядифференциации используют изменениеокраски культуральной жидкости соответственно после добавления в нееиндикатора и изменения цвета средыдополнительного культивирования, 1104153Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной микологии, и может быть использовано примикологической диагностике кандидами.козов. 5Известен ускоренный способ дифференциации грибов С. а 1 Ъсапв иС, гор 1 са 1 ь.э при их культивированиив натинной сыворотке крови, в которой при определенных условиях этигрибы через 24-48 ч инкубации образуют псевдомицелий,. что можно использовать для дифференциации этих грибов от других дрожжеподобных организмов 1 Д,15Однако указанный способ не обеспечивает высокой точности при дифференциации этих грибов, что обусловлено значительной изменчивостью дрожжеподобных грибов и недостаточной 20изученностью их морфологических особенностей.Известен способ дифференциациигрибов С. а 1 Ь 1 сапэ и С. гор 1 са 11 эот других дрожжеподобных грибов, 25включающий выращивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содержащей сыворотку крови и лактозу,определение морфологических особенностей культуры гриба, добавлениеиндикатора и регистрацию рН по изменению цвета культуральной жидкости 21 .Однако известный способ являетсядовольно громоздким и требует длительного времени (24-48 ч).35 Целью изобретения является повышение эффективности способа,Цель достигается тем, что согласно способу дифференциации грибов 4 О С.а 1 Ь 1 сапэ и С. Тгор 1 са 11 э от других дрожжеподобных грибов, включающему выращивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содержащей сыворотку крови и лактозу, определение мор фологических особенностей культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию изменения цвета культуральной жидкости, в качестве индикатора используют метиловый красный, а перед 50 добавлением индикатора проводят иересев и дополнительное культивирование в течение 4-6 ч в среде, содержащей сахароэу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации используют 55 изменение окраски культуральной жидкости соответственно после добавления в нее индикатора и изменения цвета среды дополнительного культивирования.Способ осуществляют следующимобразом.В сыворотку крови добавляют антибиотики (стрептомицин и пенициллинпо 200-300 ед. на 1 мл), стерилизуютфильтрацией через асбестовую пластинку (СФ) в фильтре Зейтца, подкисляют1 и. раствором соляной кислоты дорН 6,1-6,3 и добавляют по 20 об, 7,стерильного 157,-ного раствора лактоэына дистиллированной воде. ПроверяютрН среды, который должен быть равен6,2-6,4, При необходимости среду подкисляют или подщелачивают стерильным1 н, раствором соляной кислоты илиедкого натрия. Среду асептически раз"ливают в стерильные аглютинационныепробирки, примерно по 2,5 мл, закры"вают марле-ватными пробками и хранятв рефрижераторе при 2-4 С,Посев гриба производят 24-часовойкультурой, выращенной на агаре Сабуро с таким расчетом, чтобы в 1 млсодержалось примерно 5-7 млн. клетокгриба (определение по оптическомустандарту), Пробирку с посевом культуры гриба помещают в штатив ВСА(штатив для скашивания агара) в наклонном положении под углом 10-150,что создает оптимальные условияаэрации культуры.Через 20-24 ч инкубации при 37 С определяют морфологические особенности культуры гриба.При микроскопическом исследовании культуры гриба С. а 1 Ь 1 сапэ обнаруживают длинные извитые, часто переплетающиеся нити псевдомицелия с овальными или округлыми бластоспорами, расположенными в местах сочленения сильно удлиненных клеток псевдомицелия. В культуре гриба С. йгор 1 са 11 э преобладают длинные прямые, ветвистые нити псевдомицелия с овальноудлиненными бластоспорами, расположенными в местах сочленения клеток псевдомицелия. В культуре других дрожжеподобных грибов преобладают овальные или овально удлиненные дрожжевидные клетки, иногда обнаруживаются короткие нити псевдомицелия, состоящие преимущественно из 3-6 клеток.Окончательную дифференциацию грибов С.а 1 Ьсапэ и С.гор 1 са 11 э производят после определения дегидрогеназной активности культуры гриба и ак1104153 добавляют 2-3 капли метилового красного, приготовленного по общепринятой методике.Видовую принадлежность грибов опрецеляют по таблице.Как видно иэ таблицы, изменение цвета среды с реэазурином из сине- фиолетового в малиновый или красный в течение 4-6 ч и желтая окраска культуральной жидкости после добавления метилового красного позволяет с высокой точностью дифференцировать грибы С.а 1 Ьдсапв и С.Сгордса 11 в от других дрожжеподобных грибов. Предлагаемый способ позволяет за короткое время (24-28 ч) дифференцировать с высокой точностью грибы С. а 1 Ьдсапя и С.гор 1 са 11 я, которые являются наиболее частыми возбудителями кандидамикоэа, поэтому дифференциация этих грибов от других дрожжеподобных грибов представляет су" щественный практический интерес для микологической диагностики этого заболевания и проведения своевременных лечебно-профилактических мероприятий; Цвет среды при постановкедегидрогеназной пробы Вид гриба Сразу после Через 4-6 чпостановки инкубации С. а 1 Ь сапя Сине-фиолетовый Малиновый,красный илирозовыйМалиновый,красный илирозовыйФиолетовый Желтый Желтый С,сгцяе 1 Желтый Сине-фиолетовыйФиолетовый КрасныйилиоранжевыйЖелтый Малин овьпЪ красный или розовый Фиолетовый, иногда с темно- малиновым кольцом поверхностисреды Фиолетовый С.рвеодоСгорса 1 в или краснофиолетовыйСине-фиолетовый С.рага- Кговед Желтый С.ьч 111 егшопс 1Сине-фиолетовый или темномалиновый ВНИИПИ Заказ 5165/17 Тираж 522 Подписное Филиап ППП "Патент", г, Ужгород,ул.Проектная, 4. тивной реакции (рН) культуральной жидкости. С этой целью применяют среду, приготовленную на фосфатном буфере с рН 6,35-6,45, содержащую 207 сахаровы, 1,57. агар-агара. После двухкратной стерилизации текучим паром рН среды равен 6,10-6,25, Раствор резазурина готовят на дистиллированной воде: растворяют 1 таблетку (50 мг) индикатора в 25 мл стериль 10 ной воды и кипятят на водяной бане 20 мин. Концентрация индикатора 0,027В стерильную бактериологическую пробирку к 1 мл расплавленной и охлажденной до 45-50 С агаризированной среды с сахаровой добавляют 0,2 мл раствора реэазурина и 1 мл культураль ной жидкости, содержащей 20-24-часовую культуру гриба, выращенную в сыворотке крови с лактоэой. Содержимое пробирки перемешивают, помещают в обычный штатив и инкубируют в термостате при 37 С в течение 4-6 ч.Одновременно определяют активную реакцию культуральной жидкости (рН) 20-24-часовой культуры гриба, выращенной в сыворотке с лактозой. К 1-1,5 мл культуральной жидкости С.Тгор 1 са 11 я Сине-фиолето- вый Цвет культуральной жидкостипосле добавления индикатораметиленового красного