Способ исследования осмотической резистентности эритроцитов

(9) (11) 3(51) 0 01 Б 33 48 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.д 1 г Цч(71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР(56) 1, Авторское свидетельство СССР по заявке 9 2766905, 2703. 81,"приоритет 19742. Предтеченский В.Е. Руководство, по клиническим и лабораторным исследованиям. М., 1960, с.96 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВпутем измерения степени гемолизаэритроцитов, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью обеспечениявозможности наблюдения кинетикипроцесса, взвесь эритроцитов смешивают с гипотоническим раствором непосредственно в кювете спектрофотометра, инкубируют смесь, одновременно регистрируют оптическую плотность при длине волны 650 нм и поизменению оптической плотности взависимости от времени инкубацииопределяют осмотическую резистивность эритроцитов. йИзобретение относится к биологиии медицине, в частности гематологии,и может найти применение для изучения состояния консервированныхэритроцитов, используемых для трансФузий, а также для диагностики многих заболеваний.Определение осмотической резистентности эритроцитов служит меройновреждающего воздействия на клеткиразличных внешних Факторов, например,10фармакологических средств, различных консерватов, обеспечивающих сохранность клеток вне организма, лучевых воздействий, низких температур и т;и, 15Известен способ исследования амоти.ческой резистентности эритроцитов 13.Недостатком данного способа является отсутствие возможности оценитьдинамику разрушения клетки.Известен также способ исследования амотической резистентности эритроцитов путем измерения степени гемолиза эритроцитов 2 ,Оцнако известный способ характеризуется невозможностью наблюдения25кинетики процесса осмотическогогем.элиза.Яель изобретения - обеспечениево можности наблюдения кинетики проц: оса.30Поставленная цель достигаетсязм, что согласно способу исследова.1 ия осмотической резистентностиэритроцитов путем измерения степенигемолиза эритроцитов, взвесь эритро- З 5бантов смешивают с гипотоническимраствором непосредственно в,кюветеспектрофотометра, инкубируют смесь,одновременно регистрируют оптическуюплотность при длине волны 650 нм и по 40изменению оптической плотности в зависимости от времени инкубации определяют осмотическую резистивностьэритроцитов.Способ осуществляют следующим 45образом.Готовят основной раствор МсС 1 срН 7,4, который по своей осмотическойконцентрации соответствует 10 МС 1.Из этого основного раствора готовятряд гипотонических растворов йаСВ,Измерения проводят в кювете с длиной.оптического хода лучей 1 .см, котораятермостатируется при 20 С. Взвесьэритроцитов непосредственно в кюветеспектрофотометра смешивают с гипотоническим раствором таким образом,чтобы исходная оптическая плотностьклеточной взвеси составляла 1,0-1,2при длине волны 650 нм.сразу же регистрируют кривую зависимости "оптическая плотность-время, по которойсудят о кинетике и длительности осмо-.тического гемолиза. Степень гемолизаэритроцитов для каждого гипотоничес-кого раствора определяют по обычному 65-О; 0.75 -0,060 4 0,3 5 0,1 100,0 П р и м е р 2. Для определения осмотической резистентности эритроцитов готовят основной раствор,йаИ с рН 7,4, ггИа 01 180,00БаНРО,2731МаНРО 4 2 НО 4,86НО дист., 2000,00Осмотическая концентрация этого раствора соответствует 10 ЙеСФРазведением готовят гипотоничеокие растворы ИаСМ, г 0,9, 0,7, 0,5, 0,3 и 0,1. Для анализа берут консертройному правилу, зная при этом конечную оптическую плотность смеси За 100-ный гемолиз принимают пока" зание оптической плотности взвеси эритроцитов с 0,1-ным раствором Ицй, а за 0 гемолиза - с 0,9/46 МП р и м е р. Для определения осмотической резистентности эритроцитов готовят основной раствор,МаСе рН 7, 4 г:Ма 01 180,00 Ба 2 НРО 4 27, 31 БаНРО, 2 НО 4,862000.00Осмотическая концентрация этого раствора соответствует 10 Май, Разведением готовят гипотонические растворы МС,: 0,851 0,7 р 0,5 р О,Э и 0,1. Для анализа берут консервиро. ванную донорскую кровь с ,двухдневным сроком заготовки, 0,01 мл крови смешивают с 3 мл 0,9-ного раствора МИ (контроль), Смешившие проводят быстро и непосредственно в кювете спектрофотометра фэв 1 саш Зр 8000 ф и сразу спектрофотометрируют, записывая кривую зависимости "оптическая плотность-время". Аналогично проводят измерения в приготовленных гипотонических растворах. По характеру этой зависимости судят о кинетике и длительности гемолиза, степень, гемолиза определяют по обычному тройному правилу (см. таблицу 1.Заказ 4200/32 Тираж 823 ПодписноеВНИИПИ Государствеиного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г.Узагород, ул.Проектная, 4 вированную донорскую кровь с двухдневным сроком заготовки. 0,1 мл крови смешивают с 3 мл 0,9-ного раствора ЙмСГ (контроль) . Смешивание . проводят быстро и непосредственно в кювете спектрофотометра фоп 1 саш 5 Вр 8000 ф (длина волны 3 = 650 мм ). Сразу же спектрофотометрируют, записывая кривую зависимости "оптическая плотность - время". То же делают, помещая по 0,01 мл крови 10 в гипотонические растворыйаИ,: О, 7, О, 5, О, 3 и О, 1. О длительности процесса гемолиза судят по времени выхода кривой "оптическая плотность- время на плато. В физиологическом 15 растворе МаС 6 (0,9 в .гемолиз отсутствует, в 0,7 КаС 8 гемолиз завершается за 20 с в 0,5 ИаС 6 - за, 30 с, в 0,3 МаСЮ - за 30 с, в 0,1 ,МаИ - за 25 с.20Для определения степени гемолиза в каждом из гипотонических растворов используют исходную оптическую плотность и конечную. Исходная оптическая плотность для исследуемых образцов крови во всех приготовленных растворах,МаИ равна 1,05. Конечная оптическая плотность для 0,9 ЙаС 1,05 для 0,7 МаСВ - 1,00, для 0,5 КаИ - 0,82, для 0,3 КаС,13, для О, 1 КаСУ - О, 05. Поскольку оптиче- З 0 ская плотность (1, 05) в О, 9 МаОЙ соответствует 0 гемолиза, а оптическая плотность (0,05) в 0,1 МаСС соответствует 100-ному гемолизу, гемолиз в промежуточных гипотоничес ких растворах определяют по обычной .пропорции:1,05 - 1,00,для 0,7 ВаС 1 : в в 100=51,05 - 005 401,05 - 0,82для О, 5БаС 1 -----100 =231,05 - 0,051,05 - 0,13для 0,3 ИаС 1 - ----- 100=92451,05 - 0,05 О характере кинетики гемолиза судят по виду кривых "оптическая плот ность - время".50П р и м е р 3. Для определения осмотической Резистентности эритроци,тбв донорской консервированной крови после ее контакта с криопротекторомПЭОберут 0,1 мл этой крови и смешивают с 3 мл 0,9 Май,приготовленного 55 из основногораствора.Смешивают быстро непосредственно в кювете спектрофотометра "Уп 1 саш Бр 8000 ф. Сразу же записывают кривую зависимости "оптическая плотность - время". То же делают, помещая по 0,01 мл исследуемого образца в гипотонические растворы МасЕ ,: О,7, О,5, О, 3, О,1. Длительность гемолиза определяют по времени выходы кривой "оптическая плотность- времяф на плато. В физиологическом растворе Ма СВ (О, 9 КаСЮ ) гемолиз отсутствует (оптическая плотность во времени не изменяется ). В О, 7 МаС гемолиз завершается за 20 с,в 0,5 МаСР- за 40 с, в 0,3 МаСС - за 50 с, в 0,1 МаСЙ - за 50 с.Уровень гемолиза в каждом из гипотонических растворов определяют, зная исходную и конечную оптическую плотность исследуемых образцов в каждом из гипотонических растворов.Поскольку .оптическая плотность исследуемого образца крови в физиологическом растворе (0,9 Мас 0) - соответствует 0 гемолиза, а оптическая плотность в 0,1 МаСЮ .(=0,06.) соответствует 100-ному гемолиэу, вычисляют гемолиз эритроцитов в каждом гипотоническом растворе: 1,2 - 1,14в О 7 МаС 1: ------100=10,01,2 - 0,06 О кинетике гемолиза судят по виду кривых "оптическая плотность - время".Предлагаемый способ. позволяет, кроме степени гемолиза, определять его кинетику и длительность, а это дает возможность получить дополнителЪную информацию об особенностях осмотической резистентности эритроцитов при воздействии различных Факторов и различных патологиях, а также при подборе оптимальных консервантоВ крови.Кроме этого, способ требует меньих затрат труда и времени (на 35- 40 мин) эа счет исключения процессов экспозиции и центрифугирования.