Способ разделения нуклеиновых кислот

А СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 7 Н НИЕ ИЗОБРЕТЕН ОПИСА К АВТОРСИО П:ЛЬСТВ енкона; ордеорденагосударВ.Ломоност ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬП 3(71) Московский ордена. Ленина Октябрьской Революции иТрудового Красного Знамениственный университет им. М,сова(56) 1. Меве 1 яоп М., ЯСаЬ 1 Г.М.,7 хпо 8 гай Ю. Еццх 11 Ьгцш вейшепСаФхоп оГ шасгошо 1 есц 1 ев п цепв 1 у8 гайеп 1 я, Ргос, БаС 1. Асац. Бс 3.,08 А в, ЬЗ, 581-588, 1957,2. ОгГГ 11 Ь О,М, ВарО йепяНугай 1 еп сеп 1 г 3.1 цда 1 оп цвпф яЬог 1со 1 цшп СесЬпццев, Апа 1,Восйеш,90,35-3, 19 Т 8,3, ВгцпЕ С.Р, 1,ез.сЕ 7, ВарВ есц11 Ьг 1 цш ворусп 1 с СвС 1 га 61 епСя.ВосЬш. ВорЬув, Ас 1 а,179, 136144, 1969 (прототип). 80104624(54)(57) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНО- ВЫХ КИСЛОТ путем их центрифугирования в градиейте плотности СвС 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью сокращения длительности процесса, нуклеиновые кислоты помещают в средний слой трехслойного градиента плотности Сясь, в котором равные объемы нижнего и верхнего слоев превышают в 1-10 раэ объем среднего слоя, плотность которого равна среднему арифметическому плотно ей нижнего и верхнего слоев, различающихся на 0,20-0, 35 г/см 3, и является промежуточной между плотностями разделяемых нуклеиновых кислот или равной одной из них, и цент- р рифугирование ведут при 4000050000 об/мин,1046249 эанные с этим большие затраты электроэнергии и рабочего времени центрифуг,10 25 Способ Соотношение объемов слое Время разделения, ч;)ДНК М.гай 1 ойцгавз Хромосомная и мин В. зцЬ 1111 з тохондриальная ДНК 3,ОЙДО:3,04,50:4,5 12 Известный 17 13 Предлагаемый 2,5 1,0:1 г 1,04,0 т 1 й 4,0 10:1:10 2,0 2,0 В табл. 2 приведено разделениеДНК и рибонуклеиновых кислот (РНК )Как видно из табл, 2 отделение ДНКот РНК в предлагаемом способе идетв Зтб раза быстрее, чем в известном. Таблица 2 Способ Соотношение объемоВ слоев Время разделения, ч4 3,5:0:3,5 Известный Предлагаеьй 3,0:1:3,0 Изобретение относится к области разделения и очистки биологических макромолекул, таких как нукленновые кислоты (НК), и может быть применено в биохимии, генетике, молекулярной биологии, микробиологии и.медицинской праьвшленности.Известен способ разделения НК путем центрифугирования смеси растВОра ХЛОрнотОГО цЕЗИя СвС 1 И НК В течение 48-60 ч Г 1 3.Известен также способ разделения НК путем центрифугирования,смеси раствора СвС, и НК, заполняющей центрифужную пробирку наполовину, в течение 16 ч (.2.Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ разделения НК путем центрифугирования НК, помещанных в верхний или нижний слой двуслойного ГрадИЕНта ПЛОтНОСтИ СзС 1 С СООтНО- шением .объемов 1;1 и разницей плотностей нижнего и верхнего слоев 0,35 г/см 3 при 40000 об/мин в теченйе 12-18 ч ГЗ 3Недостатком известных способов является длительность процесса и свя" Ыз табл. 1 видно, что разделение различных ДНК по плавучей плотности в предлагаемом способе идет в 4 - 6 раэ быстрее, чем в инвест иом. Целью изобретения является ускорение процесса и снижение связанныхс ним затрат электроэнергии и рабочего времени цеитрифуг.Указанная цель достигается тем,что согласно способу разделения НКпоследние помещают в средний слойтрехслойного градиента плотности СВС 1, в. котором равные объемы нижнего и верхнего слоев превышают н1-10 раэ объем среднего слоя, плотность которого ранна среднему арифметическому плотностей нижнего иверхнего слоев, различающихся на0,20-0,35 г/см Э, и является промежуточной между плотностями разделяемых НК или равной одной из них,и центрифугирование ведут при 4000050000 об/мин,Разделение НК осущестнляется эа2-5 ч.Разделение дезоксирибонуклеиновыхкислот (ДНК) различной плавучейплотности в двухслойном и трехслойном градиентах СзС 1 приведено втабл. 1.Таблица 11046249 Составитель Г.КонноваТехред И,Метелева Корректор А.Повх Редактор А.Шишкина Заказ 7649/22 Тираж 387 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж,.Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 П р и м е р 1. В центрифужную пробирку помещают 2,0 мл раство.ра СзС 1 плотностью 1,881 г/смЗ. ДНК М 1 сгососсцз га 61 ойцгапя с плавучей плотностью 1,728 г/смЗ и ДНК Вас 11- 1 цзяцЬС 11 я с плавучей плотностью 1, 70 Г г/см З растворяют в 2, 0 мп раствора СзС 1 плотностью 1,.718 г/см 3 и наслаивают на нижний раствор, после чего наслаивают 20 мл раствора СяС 1 плотностью 1,556 г/смз, Пробирку помещают в угловой ротор и центрифугируют при 40000 об/мин, Время разделения ДНК составляет 2,5 ч. В результате получают полное разделение полос ДНК.П р и м е р 2. В центрифужную пробирку помещают 4 мл раствора СяС 1 плотностью 1,818 г/см 3. ДНК М.гяц 1 оццгапз с плавучей плотностью 1,728 г/см и ДНК В.яцЫ 11 хз с плавучей плотностью 1,708 г/см 3 растворяют в 1,0 мп раствора сзс 1 плотностью 1,718 г/см з и наслаивают на нижний раствор, после цего наслаивают 4,0 мя раствора СзС 1 плотностью 1,618 г/сМ 3, Пробирку помещают в угловой ротор и центрифугируют при 50000 об/мин. Время разделения ДНК составляет 2 ч. В результате получают полное разделение полос ДНКП р и м е р 3. В центрифужную пробирку помещают 3,0 мл раствора СяС 1 плотностью 1,854 г/см 3. Хромосомную и.митохондриальную ДНК Яассйаговус.ез сегеч 1 яае с плавучимиплотностями 1,698 и 1,685 г/смЗ,соответственно, растворяют в 0,3.млраствора СяС 1 плотностью 1,692 г/см 3.и наслайвают на нижний раствор, пос 5 ле чего наслаивают 3,0 мл раствора СяС 1 плотностью 1,530 г/см 3.Пробирку помещают в угловой ротори центрифугируют при 42000 об/мин,Время разделения хромосомной и мито 10 хондриальной ДНК составляет 4 ч. Врезультате получают полное разделениеполос ДНК,П р и м е р 4, В центрифужную г5 пробирку помещают 3,0 мл раствора СяС 1 плотностью 1,883 г/см 3. НКДНК и РНК, плотность которых превышает максимальную плотность градиента СяС 1, выделенные из В.яцЬ 1111 з,растворяют в 1,0 мл раствора СяС 1плотностью 1,708 г/см 3, равной плавучей плотности ДНК, и наслаиваютна нижний раствор, после чего наслайвают 3,0 мл раствора СзС 1 плотностью 1,533 г/см з. Пробирку помещаютв угловой ротор и центрифугируютпри 42000 об/мин, Время разделения ДНК и РНК составляет 5 ч, В результате получают полное отделениеДНК от РНК.ЗО Предлагаемый способ являетсяболее быстрым и сокращает расходыэлектроэнергии и рабочее время центрифуг (центрифугирование 2-5 ч),