Способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе

(22) Заявлеио 25. 07. 77 (21) 2512977/25-2 бс присоединением заявки Нов(51) М. Кл.з С О 1 и /28 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Я. О, Комисарчик и Е. В. Королев Институт цитологии АН СССР(54)СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ В ЭЛЕКТРОННОМ МИКРОСКОПЕ Изобретение относится к области электронномикроскопических исследований и может быть использовано при анализе структуры клеток, выделенных клеточных органелл, клеточных 5 мембран, жидких кристаллов и органических макромолекул. Известен способ приготовления срезов, применяемый в электронной 19. микроскопии, включающий дегидратацию путем последовательного замещения воды на этиловый спирт или ацетон в фиксированных денатурирующимиагентами объектах, пропитку в заливочной среде,полимеризацию и ультра- тонкую резку, связанный с изменением ультраструктуры объекта в процессе замены воды на этиловый спирт 11 .,20 Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предложенному является способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе, включающий 25 быстрое замораживание до температуры жидкого азота, возгонку воды в охлажденной вакуумной камере, пропитку в заливочной среде, полимеризацию и резку на ультрамикротоме 21 30 Недостатком этих способов является невозможность выявления неизменных структурных элементов, невозможность улучшения пропитки объекта, фиксации лиофилизированного объекта и улучшения качествамикроскопического изображения.Цель изобретения - устранение указанных недостатков.Это достигается тем, что перед пропиткой .в заливочной среде объект помещают в низкомолекулярную гидрофобную среду с последующим постепенным замещением ее заливочной средой, причем в качестве низкомолекулярной среды применяют раствор четырехокиси осмия в низкомолекулярной гидрофобной среде.Применение быстрого замораживания с последующей лиофилизацией при низкой температуре позволяет сохранить ультраструктуру объекта, так как при используемых скоростях замораживания не образуются кристаллы воды, нарушающие ультраструктуру, а сублимация витрифицированной воды при низких температурах позволяет избежать рекристаллизации.. Выдержка лиофилизированного объекта в низкомолекулярной гидрофобной1763733 15 Формула изобретения Составитель Л. ГоряйноваРедактор Ф, Серебрянский Техред Ж.Кастелевич Корректор Е. Папп Заказ 627 6 Тираж 1019 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент , г. Ужгород, Ул. Проектная,4 среде, смешанной с высокомолекулярной заливочной средой, с постепенным полным замещением первой на последнюв приводит к качественной пропитке объекта, что дает возможность после полимеризации выявитъ на срезах структурные элементы объекта в неизменном виде, Кроме того, применение раствора четырехокиси осмия в низкомолекулярной гидрофобной среде приводит к Фиксации объекта и улучшению качества электронномикроскопического изображения.П р и м е р. Приготовление срезов.Бистро изолированный из организма исследуемый объект погружазся во фреон, охлажденный жидким азотом. Иэ Фреона объект переносился в жидкий азот, где хранился до его помещения в охлажденную до заданной температуры камеру вакуумной установки, Далее производилась сублимация витрифицированной воды из объекта. После полной. возгонки воды, извлеченной из вакуумной камеры, объект быстро погружался в четыреххлористый углерод. При необходимости фиксации объекта в четыреххлористом углероде растворялась четырехокись осмия. После отмывки от несвязанной четырехокисги осмия четыреххлористым углеродом объект переносился в смесь четыреххлористого углерода с заливочной средойаралдит), концентрация которой постепенно повышалась до 100. Далее осуществлялась полимериэация при температурео60 С, резка на ультрамикротоме КВи просмотр в электронном микроскопе ЕМ. Температура жидкого фреона составляла -158 С, Рабочий вакуум камеры для высушивания объекта был 10- 10 6 мм рт.ст. Температура камеры составляла от -20 до -40 С. Концентрация четырехокиси осмия в четыреххлористом углероде 20. Объект переносился в заливочную среду из четыреххлористого углерода по следующей схеме: 6 частей четыреххлористого углерода на 1 часть заливочной среды, т.е.,6:1, затем 4:1, 2;1, 1:3, 1:6, чистая заливочная среда. В каждой смеси объект выдерживался в течение 2 ч.Использование предлагаемого способа позволяет сохранить основные компоненты в неизменном виде, улучшить пропитку лиофилизированного материала,что создает условия для его нормальной ультратонкой резки при изготовлении объектов для исследования в электронном микроскопе, а также при. структурных анализах клеток, выделенных клеточных органелл, исследуемых мембран, жидких кристаллов и органических макромолекул. 1. Способ приготовления объектовдля их исследования в электронноммикроскопе, включающий быстрое замораживание до температуры жидкого азота, возгонку витрифицированной водыв охлажденной вакуумной камере, пропитку в заливочной среде, полимеризагцию и резку на ультрамикротоме, о тл и ч а ю гц и й с я тем, что, с цельювыявления неизменных структурных элементов и улучшения пропитки объекта,перед пропиткой в заливочной средеего помещают в низкомолекулярную гидрофобную среду с последующим постепенным замещением ее заливочной средой,2. Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью фиксации лиофилизированного объекта и улу 35 чшения качества микроскопическогоиэображения, в качестве низкомолекулярной среды применяют раствор четырехокиси осмия в ннзкотемпературнойгидрофобной среде. 40Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 5)оа Ьгапд Г. 5. Е 1 есггопМ 1 сгоьсор 11 оТ Се 11 ь апд Т 15 ьоеь,45чо 1.1,И ЧгЬопйоп, 1967, р. 188-219.2, Вгоип апд Веггг,е, ТехгЬоо 1 оГСуйо 1 оду, ТЬе С.Ч. МоьЬу Соврапц,1969, р. 15-19,