Способ подготовки колоний бактерий для электронной микроскопии

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет -Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(71) Заявитель Всесоюзный ордена Ленина институт экспериментальной ветеринарии(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КОЛОНИИ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в процессе проведения микробиологических,цитологических, цитохимических, иммунобиологических и других исследований,Известны способы подготовки колоний бактерий для изучения их структурной организации с помощью электронного микроскопа, заключающиеся в нанесении на поверхность агара пленки коколлодия на амилацетате, посеве бактерий на эту пленку, инкубировании их в термостате, разрезании пластинки агара с пленкой и колониями бактерий на кусочки 8-10 мм, погружении в дистиллированную воду, осторожном удалении агара под углом 45 о, подведении сеточки под пленку с бактериями и высушивании ее; в сьывах колоний бактерий с агара раствором Фиксатора (для максимального сохранения поверхностных структур), немедленном центрифугировании, постфикации осадка, заключении объектов в расплавленный агар, нарезании мелких кусочков застывшего агара с биологическим материалом с последующим общепринятым заключением в эпоксидные смолы 1(,(21 . Щ Недостатками таких способов являются многоэтапность и использование физических Факторов, вызывающих ряд артефактов, в результате чего происходят потери микроорганизмов в процессе фиксации и яследующей обработки материала, нарушение пространственных взаимосвязей бактерий в колонии, нарушение ориентации самих колоний в сравнении с первоначальной, артефакты в структурной организации бактерий. Известен также способ вырезания кусочков агара с колониями и последующей их фиксацией. Для этого выращивают бактерии на плотной питательной среде, вырезают кусочки агара с колониями и переносят их в растворфиксатора с последующей обработкой для электронной микроскопии 3.Недостатками такого способа являются потеря биологического материала и нарушение исходной орИентации колоний. Ориентация нарушается во время переноса кусочков агара с колониями в фиксирующий раствОр. Кроме того, агар во время полимеризации эпоксидных смол (при температуре более ,высокой, чем точка плавления агара) смешивается с этими смолами, что мо742461 Форчула изобретения 25 Составитель М, БелоусоваРедактор М. Рогова Техред И.Асталош Корректор Н. Стец Заказ 3407/27 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 жет служить одной из причин артефактов ультраструктуры бактерий.Цель изобретения - исключение потери микроорганизмов в процессе подготовки препаратов и сохранение их исходной ориентации в колониях.Это достигается тем, что перед помещением бактерий на покрывные стекла последние предварительно покрывают слоем яичного белка. Способ дает воэможность сохранить пространственную ориентацию и структуру колоний, предотвращая их потери при последующей обработке, исключает действие травмирующих Факторов ускорение, высокая температура, расплавление агара при полимеризации и др.), вызывающих различные артефакты.Способ осуществляется следующим образом.На чистые покрывные стекла наносят максимально тонкий (не более 0,2 мм) слой яичного белка и дают ему подсохнуть при комнатной температуре в течение 2-3 мин. После этого белковой поверхностью стекла прикасаются к колониям, выросшим на агаре. При этом колонии бактерий легко прилипают к белковому слою. Сразу после этого покрывное стекло с колониями опускают в раствор фиксатора (колониями вверх) . Дальнейшая проводка осуществляется по стандартной методике. При этом, благодаря наличию белкового слоя на покрывном стекле, колонии микроорганизмов не открепляются. Далее покрывное стекло со стороны погружают в эпоксидную смолу (плоская заливка) . После полимеризации эпоксидной смолы с погруженными в нее колониями бактерий покрывное стекло также, благодаря наличию белкового слоя легко снимается с помо(щью жидкого азота (для чего погружают стекло в жидкий азот на 3-5 сек),Предлагаемый способ испытывался в течение 4-х лет в лаборатории биофизики. Результаты испытаний сравнивались с результатами, полученными приснятии колоний на покровные стеклабез предварительного нанесения белкового слоя, и с результатами способа,принятого за прототип. Время проводки материала до заключения в эпоксидные смолы варьировало от 6 до 96 часбез потери колоний, что позволяет использовать предлагаемый способ дляподготовки к электронно-микроскопическому исследованию колоний бактерий разных видов, отличающихся проницаемостью клеточных стенок и требующих разной по длительности обработки для электронной микроскопии.Предлагаемый способ обеспечивает 15 сохранение ориентации колоний, соответствующей их росту на плотной питательной среде, и позволяет на серийных параллельных срезах изучатькак ультраструктуру, так и простран.20 сгвенные взаимосвязи бактерий на разной глубине бактериальных колоний. Способ подготовки колоний бактерий для электронной микроскопии,включающий помещение бактерий напокрывное стекло и их Фиксацию,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью исключения потери микроорганизмов в процессе подготовки препаратов и сохранения их исходной ориентации в колониях, перед помещениембактерий на покрытые стекла последние предварительно покрывают слоемяичного белка.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе40 1. Нз.И ег Ю., Кпаув 1 3., Во)сег Е.,Вас 1 1 1948, т. 56, с. 569 в 5.2. Высоцкий В. В. и др. ЖМЭИ,1977, т. 8, с. 90-95,3. Константинова Н. Д. и др. ЖМЭИ.1977, т. 4, Р с. 50-53.