Способ получения модифицированного глобина

(22) Заявлено 080877., (21) 2544365/28-13 с присоединением заявки Мо - . А 61 К 37/02 А 61 3( 35/14 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(53) УДК 615.45:616, . .155.16(088.8) Дата опубликования описания 080680(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГОГЛОБИНА Изобретение относится к медицинской промьталенности и касается получения белковых препаратов - плазмозаменителей.Известен способ полуумения модифи цированного глобнна иэ эритроцитов донорской крови путем отмывания эритроцитов от остатков плазменных белков и лейкоцитов, гемолиэа эритроцитов, удаления стромы, выделения гло О бин-гидрохлорида, щелочного гидролиэа с последующей нейтрализацией щелочного раствора глобина, очисткой и стерилизацией 1).Однако известный способ является 15 трудоемким и выход глобина состав.ляет 61.Целью изобретения является упрощение технологии производства и повышение выхода целевого продукта, 20Эта цель достигается тем, что рН раствора гемоглобина освобожденного от стромы доводят до 2,0-2,4 при температуре 6-10 С, добавляют раствор перекиси водорода, повышают темпера туру до 50-54 С, проводят гидролиз при рН 12-13, центрифугируют, добавляют этанол,при температуре -5-7 С и при рН 5,7-5,9, центрифугируют, добавляют глюкозу. 30 2Способ осуществляют следующим образом,П р и м е р . Эритроциты крови человека любых сроков хранения одной или всех групп крови (смешанные), содержащие один из обычных цитратныХ антикоагулянтбй, триждЫ отмывают физиологическим раствором хлористого натрия, используядля этой цели центрифугирование при 2500-3000 об/мин при температуре 4 С. Лейкоцитарную пленку удаляют сифоном. Отмывание проводят из расчета 2 объема 0,9-но- го раствора хлористого натрия на 1 объем эритроцитов.Отмытые эритроциты помещают в ре актор, К 1 объему эритроцитов добав-. ляют 2 объема апирогенной охлажденной до 4 С воды и оставляют стоять в течение 1 часа для протекания гемолиза.Затем доводят рН раствора до 5,60,1 свежеприготовленным 1 н. раствором соляной кислоты при перемешивании в течение 60-90 минут. При этих условиях из гемолизата выпадает в осадок строма эритроцитов. Для ее .удаления смесь центрифугируют при температуре 4 С в суперцентрифуге при 15000-20000 об/мин или в стаканчиковой - при 2500-3000 об/мин.. 1 аф."3738622 Формула изобретения ЦНИИПИ Заказ 2710/5 Тираж 673 Подписное Филиал ППП Патейт, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Освобожденный от стромы раствор гемоглобина заливают в реактор и доводят рН до 2,2+-0,2 2 н. раствором соляной кислоты. Температуру смеси понижат до 8+2 С. Затем к смеси прибавляют 6-ный раствор перекиси водорода из расчета .300-330 мл на 1 литр исходного раствора гемоглобина и перемешивают в течение 12-18 часов. После перемешивания температуру смеси повышают до 5242 С, выдерживают в течение 1 часа и добавляют 2 н. раствор МаОН из расчета 190 мл на 1 литр исходного растворагемоглобина для достижения рН 12-13. После добавления целочи смесь выдерживают при указанной температуре 60-90 минут. За тем к смеси прибавляют 15-16,5-ный раствор перекиси водорода иэ расчета 50 мл на 1 литр исходного раствора гемоглобина и прогревают при указанной температуре не менее двух часов, 20 параллельно контролируя изоточку глобина. Если изоточка глобина находится в пределах рН - 5,5-6,5, то процесс очистки его от гема закончен, а сам белок является водорасФворимым ц при нейтральных значениях рН.Смесь охлаждают до 18-20 С и доводят рН 1 н. раствором соляной кислоты до 7,2-0,2, Смесь центрифугируют+для удаления части гема при комнатной температуре и 2500-3000 об/мин в течение 30 минут, Затем понижают температуру центрифуга до 0 С и начи:дают прибавлять 96-ный этанол до конечной концентрации его в смеси 12-15, параллельно продолжая понижать температуру до -б 1 С, Смесь перемешивают в течение двух часов (при необходимости в производственных условиях перемешивание можно осуцествлять в течение 12-18 часов) . За тем рН смеси доводят 1 н, раствором соляной кислоты до 5,8+0,1 и центри фугируют при -61 С, 1500-2000 об/мин в течение 20-30 минут. Надосадочную жидкость, содержащую экстракорпускулярный калий, низкомолекулярные фрагменты глобина и азотистые продуктыудаляют и в дальнейшем не используют.Модифицированный глобин экстраги-руют из осадка добавлением к нему10-ного раствора глюкозы в соотношении 1:5 или 1:б. Экстракцию проводят при температуре +4 С, рН - 9-10в течение 8-12 часов. После чегосмесь центрифугируют при 25003000 об/мин в течение 20-30 минут. Осадок, содержащий денатурированныестромальные липогликопротеиды счастью гема, удаляют, В полученномрастворе коррегируют прибавлением10-ного раствора глюкозыконцентрацию белка до 6-8 г , а рН до 72+0,2 1 н, раствором соляной кислоты.Раствор препарата стерилиэуют в условиях бокса через керамические фильтры Ф, разливают во флаконы емкостью 250-500 мл, герметически укупоривают. Срок годности препарата не менее 2 лет. При лиофилизации раствора глобина с глюкозой срок годности увеличивается в 2 раза.Препарат представляет собой б 8-ный раствор модифицированного белка - глобина с 10-ной глюкозой стабильного водорастворимого при нейтральном значении рН, Относительная вязкость 2,0-2,4, содержит до 20- 30 мгостаточного азота, содержание Ре в препарате не превышает 3 мг , количество хлористого натрия равно О,8-1,2 г , при электрофорезе на бумаге или на агаре Шйсо,белок препарата перемешивается одним пятном и по своей подвижности близок к подвижности преальбумина сыворотки донорской крови.Описанная технология позволяет получить стерильный, апирогенный лишенный вируса гепатита, нетоксичный препарат, пригодный для внутривенного введения в качестве плазмозаменителя.Выход целевого продукта модифицированного глобина достигает 70-76 от его содержания в исходном гемолиэате,Предлагаемый способ обеспечивает повышение выхода глобина и упрощает технологию производства. Способ получения модифицированно.го глобина из эритроцитов донорскойкрови путем отмывания эритроцитов отостатков плазменных белков и лейкоцитов, гемолиза эритроцитов, удалениястромы, выделения глобин - гидрохлорида, целочногО гидролиза с последующей нейтрализацией целочного раствора глобина, очисткой и стерилизацией,о т л и ч а ю щ и й ся тем, что,с целью повышения выхода, упроцениятехнологии производства, рН растворагемоглобина, освобожденного от стромы, доводят до 2,0-2,4 при температуре +6-10 С, добавляют раствор перекиси водорода, повышают температуру.до 50-54 С, проводят гидролиз прирН.12-13, центрйФугируют,добавляютэтанол при температуре -5-7 С и прирН 5,7-5,9,. центрифугируют, добавляют глюкозуИсточники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 1 аЬох 1. СХ 3.п, Мей., 1951,37, б,