Способ иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл. С 08 Е 220/56 с присоединением заявки Мо Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(71) Заявитель Таллинский политехнический институт(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕИзобретение относится к биохимичесФкой технологии, связано с разработкойбиохимических методов анализа.Применение иммобилиэованных ферментов позволяет создать новые методыанализа веществ биохимического характера, основанные на применении ферментных электродов, колонок с иммобилиэованными ферментами и т,д,10Известен способ иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле путемрадикальной полимериэации в водномрастворе, содержащем 0,1-2 вес,Ъ фермента, акриламида и М,И-метиленбисакриламида в соотношении 95:5 соответственно. В полимеризационную смесьдополнительно вводят высокомолекулярный йолисахаридкрахмал 1). Так, на-пример, полимеризационную смесь, содержащую (%) 16,7 акриламида, 0,53,Н,И-метиленбисакриламида, 10 акрилатанатрия, 0,17 фермента каталазы и1,67 крахмала замораживают и облучают радиацией 0 Со дозой 54 крад. 25Иммобилиэованная каталаза сохраняла94,1% исходной активности. Этот способ ускоряет полимериэацию и увеличивает степень полнмеризации мономеров нри радиационной полимеризации замороженной смеси . В случае особенно чувствительных ферментов, таких как пропионилхолинэстераэа,применение крахмала не дает нужногоэффекта. Это связано с тем, что из -за высокого молекулярного веса крахмала практически невозможно ввестиего в реакционную смесь в концентрации более нескольких процентов,Недостатком известного способа является то, что низкая концентрацияполисахарида не обеспечивает достаточное сохранение активности пропионилхолинэстеразы во время иммобилизации,Целью изобретения является уменьшение инактивации фермента в ходеполимеривации,Укаэанная цель достигается тем,что в водный раствор вводят сахарозув количестве 15-50 вес.В, Применяютрадиационную полимеризацию, а такжехимическую полимеризацию с использованием в качестве катализатора смесинадсернокислого аммония и И,Н,Н,В -Формула изобретения Составитель А,ПереверзеваТехред О. Андрейко Корректор О, Ковинская Редактор Е.Хорина Заказ 4011/24 Тираж 584 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытиЯ 113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5 филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 3 6736воое сахаоозы в 0,06 М боратном буФере,рН 6,0. б объемов полученногораствора смешивают с 2 объемами 50 ногу раствора мономеров (акриламид иЫ,н-метиленбисакриламид в соотнсиаении 955), в качествейницйатоЗавдобавляют 1 объем 2,5-ного раствора 5Я,Н,В,й -тетраметилэтйлеидиамина и 1объем 2,5-ного раствора надсернокислого аююния. Все растворй перед смешением охлаждают до 1-УС и цопучен-йуЖ смесь выдерживают при той же температуре 2 мин. Полученный блоК геля "-измельчают протираниемЧерез сито сотверстиями 0,6 мм, далее препаратпромывают выаеуказанным буфернымраствором исохраняют до примененияв холодильнике. Сохранение активностипри иммобилизации не ниже 30 6 г ис- .ходной.П р и м е р 2. Пропионилхолинэстераэу растворяют в 50 нбм растворе сахарозы в 0,06 М боратном буфере,рН 6,0, 8,6 объемов полученного раствора смешивают с 1,4 объемами 50-но-.го раствора мономеров. Полученнуюсмесь облучают-лучами, доза радиации6 крад. Раствор вйдерживают во времяоблучения при 0 С. Измельчение и промывку проводят, как в примере 1. Сохранение активности не ниже 15 отисходной. Без наличия сахаровы в этихусловиях гель ие образуется. 30П р и м е р 3. Аминоацилаэу растворяют в 50-ном растворесахарозы в0,1 М фосфатном буФере, рН 7,2. 7объемов получейного раствора смешивают с 3 объемами 50-ного раствора мономеров (акриламид и И,Б)-метиленбисакриламид в соотношении 95;5) . Полученный раствор облучают -лучами,доза радиации 15 крад. Раствор выдерживают во время облучения при 0 С, 4оПолученный блок геля измельчают проти 42 4раннем через сито с отв ерсти ями 0,4 мм, полученный препарат промыва- ют вышеуказанным буфером. Сохранение активности не ниже 15 от исходной.Полученные результаты показали, что высокие концентрации (15-50) сахароэы значительно ускоряют образование полиакриламидного геля из мономеров и придают гелю более однородную структуру. Опыты показали, что в присутствии сахароэы реакцию полимериэации акрильных мономеров можно провести при более низких концентрациях инициаторов или при зна-чительно более низких дозах радиации, что уже.само собой уменьшает инактйвацию Фермента в ходе полимериэации. кроме того, проведение полимериэации в присутствии сахароэы выявляет опре- деленное защитнор действие и позволяет получить гели, стабилЬность которых при работе в несколько раз выше стабильности, полученной. обычной полимеризацней. Способ иммобилизации ферментов в полиакрилаиидном геле путем радикальной полимеризации в водном растворе, содержащем 0,1-2 вес, Фермента, акриламида и Н,Б-метиленбисакриламида з соотнааений 95:5 соответственно, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью уменьшения степени инактивации фермента в процессе полимериэации, в водный раствор вводят сахароэу в количестве 15-50 вес Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Патент Японии Р 7442876,кл. 36/2/ С 05, 22.04.77.