Способ расщепления полирибонуклеотидов

Саюз Советскик Сециапкстмческик республик(61) Дополнительное к авт. свил-вуЗаявлено 31,12,75(2) 2300 23-04 КЛ.07 П 21/ с присоединением заявкиГосуд Приоритетомит арствеииыи СССР едаи изоо и открыт6 ковано 15027 5,02 убликования опнсани ат 2) Авторы изобретения,Машкова олекулярной биологии АН ССС(54) СПОСОБ РА овершения полирения по- мо- итиЛл вичной струкв и РНК вомо избирателпо уридиновыможно по изя установления ке полирибонуклеотид х случаях необход асщепление только ям, которое невоз ому способу.лью изобретения я ьное расщепление в по уридиновым з варительнойтида смесьюьфита натпературерН 8-9, веотнда пирис последуюв реакции. тур мноное в и прибонуклеазойодукто вест Цвляется иэбиполирибонуклевеньям. рате отид Изобретение относится к усствованному способу расщеплен рибонуклеотидов с целью расшинабора способов, необходимых прианализе первичной структуры рибонукиновой кислоты (РНК).Известен способ расщепления поли рибонуклеотидов с применением пирим диловой рибонуклеазы с последующимразделением продуктов реакции извесными методами.До стадии расщепления полирибонуклеотидов рибонуклеазой (РНКаза) предварительно вводят водорастворимый карбодиимид, что позволяет блокировать расщепление пиримидил.РНКазой по уридиновым остаткам и зволяет специфически расщеплять дифицированный полимер лишь по ц диловым остаткам. ЛЕНИЯ ПОЛИРИБОНУКЛЕОТ Поставленная цель достигается предварительной обработкой полирибо нуклеотидов смесью метоксиамина и метабисульфита натрия при рн 50,1 температуре 37-40 С и инкубацией при рН 8-9.Предварительная обработка полирибонуклеотидов приводит к устойчивости Фосфодиэфирной связи между цитидиновыми основаниями модифицированными совокупным действием мето ксиамина и метабисульфита натрия и соседним в 3-положении нуклеотидо при гидролизе пиримидил-РНКаэой.В результате при действии на любые модифицированные полирибонуклеотиды пиримидил-РНКазой образуются олнгорибонуклеотиды, содержащие уридиновые остатки лишь в З-положении, т,е расщепление Ферментом цепи происходит лишь по уридиновым звеньям.Способ состоит в предобработке полирибонуклеометоксиамина и метабисулрия при рН 5-0,1 при тем37-40 С и инкубацирасщеплении полиримидиловой рибонуклщим разделением прФормула изобретения 40 Составитель Л.Ние(улинаРедактор Л.НОвожеелова ТехредЮ.Ниймет Корректор д,Мельниченко Заказ 24."1/21 Рираж 512 Подписное 11 НИНПН 1 осуДарстВенного 1(Омитетс 1. СС Р по делам изобретений и открытий 113035 Москва, )1(-35 Раушская наб.,д.4/5Филиал ППП "Патент, г.ужгород, УЛ.Проектная,4 П р и м е р;0,5 мг РНК из 50 брибосомных субчастиц 1(.соб инкубирую в течение 4 ч при 37-40"С в О, 1 млраствора, содержащего 125 г/л метоксиамина и 380 г/л метабисульФитанатрия при рН 5-0,1 После окончания реакции РНК наносят на колонкуОбеьемОм 5 мл напОлнее 1 ную смолойСеФадексом Г. Смола 1 з колонкеуравновешена водой при рН 8., Скоростьпротока жидкости через колонку5 мл/ч, С 1,7 до 3 мл собирают раствор, содержащий РНК, освобожденнуюОт модиФикаторов. Раствор упариваютдо 0,5 мл, Добавляют аммиак ДО РН 89 и выдерж(-:Бают Б теченеее 12- .: с 1при комнатной температуре для демодиФикации остатков урйдина.К 0,5 мл раствора РНК добавляютб.П(арбое(ат аммония ДО рН 8 и О, 002 гпиримидил-РНКа.зы и выдерживают псои37-38 С В течение 24 чЗатем раствор наносят на колонкуобеьемом 2,5 ил,. заполненную смолой,ЦВАК-СеФадексом й, Смола в колонке уравновешена буФером Р., содержашлы, г/л ;, 242 оксиметиламинометанатрис и 420 мочевеены,РННа колонку подают раствор из двухпоследОБательно сОединепных сОсудОВ;в перво сосуде буФерный раствор 11Во Втором "- буФерный раствор ВРастБОР ФосфомонозстеРсазыО, 6 г,11при рН 8-0 1 и 37=40 С.Полученный образец угаривают инаносят на пластинку 16 х 16 см, поО:1 кеЕМ слоем цееллюлозы (3, Зг),Пласте(11;.;-: Номе;-,:а 1 вт Б геюметпчнь 1 ирезервуар, на дно кОтОРОго наливают100 мл раствора нормального бутанола, насыщенного водой.Восходящую хроматограФию Б зтойсистеме п 1 зоводят при комнатной температуре Б тесеение 3-5 ч, пока граница поднимающегося раствора неДОстигает БерхнеГО края пла тинки,По данным хроматогРаФИН еДинственным движущеемся н клеозидОМ в ае 1 ализиРу - мой; меси е(влпет, я ссРидие 1 Ост авшися на старте материал элюируют с пластины и гидролизуют до нуклеотидов 18-часовой инкубацией в 0,3 М КОН при 37-38 С. Раствор нейтрализуют НСВО 4 , удаляют КС 004 центриФугированием при 3000 об/мин и наносят на кварцевук 1 пластину (16 х 16), покрытую тонким слоем целлюлозы.Восходящую хроматограФию проводят Б системе - нормальный бутанол, насыщенный водой, е которой движутся лишь нуклеозиды. В результате деФосФорилирования и щелочного гидролиза СМССИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ НУКЛЕОЗИДНЫМ является лишь 3"концевой остаток, соответствующий уридину.Остальной материал выскребают с плас-.ины, элюирукт водой, деФосФОРилируют, Хрома.О 1 раФия в тонком слое обнаруживает,что материал состоит лишь из остатков 1 м "метОксицитидина, аденози 11 а и гуанозина. В процессе ан(.лиза збнаружено, что6"Дитидро-стль(1 р Г-метоксицити дин пр;вращается в ".Е-метоксицити" пин при обр;.ботке 0,.3 М КОН при 37-38"С за 3 чв Уаке 1 м образом, исходные олигов)уклеотиды содержат уридин лишь на 3 конце, т,е. описанное расщепление поли.,(ера проходит лишь:1 о остаткам уридие 1 сс:. СпециФи"ность расщепления дост.:;точно Высока, так как не обна- РУЖЕ:-;О ПРИ З.;:аЛИЗЕ С",.с Таьа ОЛИГО- нуклеотидов никаких продуктов, кроме у 1( а 3 а:1 нь 1 х,Способ расщепления полирибонуклеотидов с применением пиримидиловой рибонуклеазы с последующим разделением продуктов реакции, о т л и ч аю щ и й с я тем, что с целью избирательного рс.сщепления по уридиновым звеньям,полирибонуклеотид предварительно Обрабатывают смесью метокс 1(аме 1 е 1 а и метабисульФита натрия при рН 5=0,1 и температуре 37- 40 С. а затем е 1 нкубирчют пРи рН 8-9.