Способ определения хиноксидоредуктазной активности

О П И С А Н И Е пп 1) 582556ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(21) 2059451/13 1 Я 3 с присоединением явкисударственныи комитет оеета Министров СССР о делам изобретенийн открытий 23) Приоритет(53) УДК 577.15(08 юллетень12 публиковано 30.03.77. ата опубликования оп сания 07.04,7 2) Авторы изобретеш Е. Ф, Лунец, Э, П. Титовец и Г, Г. Петровск Белорусский научно-исследовательский инстит неврологии, нейрохирургии и физиотерапии(71) Заявител СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗНО АКТИВНОСТИ 2 подошедше ормы этог ирения диапазона качестве суострат- метокси - 1,2 водят полярограф псследуе- используензохинон ческое опИзооретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и патофизиологических исследованиях обменных процессов во всех тканях и жидкостях человека.Известен способ определения НАД (Ф) Н никотинамид аденин динуклеотид фосфат восстановленный хинон-оксидоредуктазной активности, основанный па регистрации убыли НАДН Н+ или НАДФН Н+ в среде инкубации фермента путем измерения оптической плотности при длине волны 340 нм, или по восстановлению 2,6-дихлорфенолиндофенола - измерение поглощения света с длиной волны 600 нм.Однако известный способ нельзя применять, если исследуемые препараты поглощают свет в той же области спектра, что и применяемые субстраты, или сильно рассеивают свет (мутные образцы). Кроме того, при использовании этого способа нельзя проводить определение НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности в тех объектах, в которых наряду с определяемой активностью присутствуют и другие ферменты, взаимодействующие с пиридиннуклеотидами.С целью расшмых объектов в ают 4-анилин - 5 б(АМОБХ) и прои ределение количества кислорого па окисление восстановлен ф охинона.Способ определения НАД(Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности заключается втом, что определение проводят при комнатнойтемпературе в закрытой полярографическойячейке, в которую последовательно помещаютсреду инкубации (солевой буфер) рН 7,5,НАД (Ф) Н Н+ (400 мкМ), АМОБХ (150 мкМ),дезоксихолат (1500 мкМ), цианид (2000 мкМ),после чего в ячейку добавляют исследуемыйматериал.При наличии в исследуемом материале15 НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности в среде, содержащей все требуемые попредлагаемому способу компоненты, начинаются реакции, протекающие в такой последовательности.20НАД(Ф) Н НАМОБХ==НАД(Ф)+АМОБХ Н (1)АМОБХ Н+05 О=АМОБХ+Н 20 (2)Уменьшение концентрации кислорода вслед 25 ствие использования его на окислениеАМОБХ Н, (реакция 2), который появляетсяв среде в результате НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности исследуемого материала (реакция 1), измеряется полярографи 30 чески,552556 Формула изобретения Составитель С. МалютинаРедактор М. Дмитриева Текред А. Камышникова Корректор Л. Орлова Заказ 685/13 Изд. М 310 Тираж 1054 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 На прилагаемой полярограмме изображена типичная кривая, отражающая изменение концентрации кислорода в среде инкубацип исследуемого материала, обладающего НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активностью, где М - добавление исследуемого материала,По полярограмме рассчитывают максимальные скорости потребления кислорода в среде, которые равны тангенсам углов наклона касательных к кривым в точках с максимальными скоростями. Согласно представленной последовательности протекающих в ячейке реакций стехиометрические соотношения НАД(Ф) НН+; АМОБХ; О равны 1: 1: 1. Следовательно, скорость потребления кислорода в системе будет количественно отражать величину НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности исследуемого материала, которая может быть выражена в единицах:мк атом кислорода1сек г белка или с учетом стехио метр ии компонентов мк моль НАД(ф)Н Н+ сек г белкаЕсли исследуемый материал представляет собой гомогенную систему, то определение проводят без добавления в среду дезоксихолата.Если исследуемый объект не обладает свойством поглощать кислород в результате собственного дыхания, то определЕниеНАД(Ф) Н; хинон-оксидоредуктазной активности проводят без добавления в среду цианида,В качестве среды может быть использованлюбой солевой буфер изотонической или близкой к изотонической концентрации (предпочтительно использовать фосфатный буфер вконцентрации 1/15 М).10 рН буфера может варьировать и пределах5,5 - 8,5 ед. (оптимальная величина 7,5).Предлагаемый способ позволяет определитьНАД(Ф) Н: хинон-оксидоредуктазную активность в образцах с различными спектральны 15 ми характеристиками, в сильно рассеивающихсвет или полностью непрозрачных объектах,в присутствии различных ферментативных активностей, окпсляющих или восстанавливаюгцих пиридиннуклеотиды, независимо от по 20 бочных неферментативных реакций, в которыевовлекаются применяемые субстраты. 25 Способ определения хинон-оксидоредуктазной активности, заключающийся в определении концентрации субстрата, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью расширения диапазона исследуемых объектов, в качестве субстрата 30 используют 4-анилин - 5- метокси,2- бензохинон и проводят полярографическое определение количества кислорода, пошедшего на окисление восстановленной формы этого хинона,