385436

Союз Советских Социалистических РеспубликЗависимый от патента-М. Кл. С 07 с 101/00 Заявлено 03.11,1971 ( 1619741/23-4)Приоритет 07.11.1970,Р 2005658,0, ФРГОпубликовано 29 Х.,1973. Бюллетень25Дата опубликования описания 16.Х.1973 Государственный комитет Совета Мкнистров СССР по делам изобретений и открытий(088.8) Авторизобретения Иностранец Рольф ГайгерИностранная фирма Фарбверке Хехст АГЗаявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗФЕНИЛАЛАНИН В-ИНСУЛИНА Изобретение относится к способу получения дезфенилаланин В-инсулина, применяемого,в медицине.Известный способ получения инсулина расщеплением по Эдману с применением соответствующего изотиоцианата сопровождается образованием смеси продуктов, трудно разделяемых хроматографически.Этот способ используется для получения небольших количеств указанных продуктов и прежде всего для аналитических целей.Предлагаемый способ получения дезфенилаланин В-,инсулина заключается в том, что инсулин в смеси, состоящей из амида Х, - диалкилкарбоновой кислоты и водного буферного раствора с рН 8,0 - 9,0, обрабатывают изоывком трет-бутилоксикарбонилазида с последующей обработкой полученного продукта фенилизотиоцианатом и затем сильной кислотой, папример трифторуксусной.В качестве исходного продукта может быть использован инсулин различных видов, преимущественно инсулин крупного рогатого скота, инсулин свиньи или смесь этих инсулинов в любом соотношении.Для проведения реакции, например, суспендируют или растворяют 1 ялго,гь инсулина в 30 - 70-кратном весовом количестве амида К, К-диалеилкарбоновой кислоты, который может содержать до -25% воды, Затем добавляют 20 - 75 лглоль трет-бутилоксикарбонилазида и 2,5 - 4-кратное количество (по отношению к весу введенного инсулина) буферного раствора,и перемешивают 3 - 6 час 5 угри 35 - 40 С. При комнатной температуререакция протекает значительно медленнее ч требует больше времени.Ди-трет-бутилоксикарбонилинсулин осаждают эфиром, сушат в вакууме над РОв, 10 растворяют в 20 - 50 чкратном,количестве 60 95%-ного водного,пиридина, добавляют 1,5- - 4 лглоль фенилгорчичного масла, которое может содержать заместители, и перемешивают 3 - 20 час при комнатной температуре. Реак цию обычно заканчивают при появлении мути. Продукт реакции осаждают эфиром, выдерживают 1 - 2 час в 10-кратном весовом количестве триф тор уксусной кислоты, вновь осаждают эфиром и,кристаллизуют пзвест ным способом при рН 5,0 - 5,5.Во всех примерах для характеристикиацилированных инсулинов используют электрофорез на бумаге (6 час, 200 в, уксусная кислота - муравьиная кислота, рН 2, индч катор бромфеноловый синий); для контроляотцепления фенилаланина - электрофорез и анализ с аминокислотой.П р и м е р 1. К раствору 1 г (0.167 льяоль)инсулина свиньи в 70 лгг 80%-ного диметила цетамида добавляют 1,45 г (10,нлголь) трет3854 ол течение 1 час при 40 С получают 725 мг дезфенилаланин Внсулина (свиньи). 5 П р и м е р 5. Из 1 г смеси инсулина крупного рогатого скота и инсулина свиньи, как в пригмере 1, но при использовании 0,3 ммоль 4-нитрофенилизотиоцианата и проведении реакции в течение 2 час при комнатной темпе ратуре получают 780 мг дезфенилаланин В- инсулина.П.р и м е р 6, Как в примере 1, из 1 г ин.сулина крупного рогатого скота при использовании 0,4 лгяголь 4-хлорфенилизотиоцианата 15 и,проведении реакции в течение 3 час прикомнатной температуре получают 765 мг дезфенилаланин В-инсулина (крупного рогатого скота).П р и м е р 7, Аналогично пргамеру 1 из 20 1 г инсулина свиньи при использовании 0,3ммоль 3-трифторметилфенилизотиоциагната и проведении реакции в течение 2 час при комнатной температуре получают 770 мг дезфенилаланин В-,инсулина (свиньи).25 Спосоо получения дезфенилаланин В-ин сулина, отличаюгггггйся тем, что инсулин всмеси, состоящей из амида М, Х-диалскилкарбоновой кислоты н водного буферного раствора с рН 8,0-9,0, обрабатывают избытком трет-бутнлоксика р бонилазида с последующей 85 последовательной обработкой полученногопродукта фенилизотиоцианатом и сильной кислотой, например трифторуисусной. Составитель И. Гудкова Текред Е. БорисоваРедактор Т. Шартаиова Заказ 508/1554 Изд. М 551ЦИИИПИ Государственного комитетапо делам изобретений иМосква, Ж, Распекая Тип. Харьк. фил. пред. Патент бутилоксикарбонилазида и З,З мл (3,3 лгмоль) 1,н. бикарбоната натрия, перемешивают 5 час при 35 С, упаривают,в вакууме при 50 С, растирают остаток с эфиром и,получают 1,275 г солесодержащего продукта, который после обработки 20 мл 2%-ной уксусной кислоты, дает 945 мг Х" (А 1) - Кв (В 29) - дитрет-бутилоксикарбонилинсулина (свиньи).Полученное соединение растворяют в 4 мл 95%-ного пиридина, добавляют 0,0365 мл фенилизотиоцианата, перемешивают 4 час при комнатной температуре, упаривают,в вакууме при температуре максимум 50 С до небольпгого объема, осаждают эфиром и выделяют 820 мг Х" (А) М (В 29) -ди-трет-бутилогкснкарбонил-Х"(В 1) - фснилтиокарбамоилинсулина (свиньи), которые выдерживают 1 час в 8,5 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре, добавляют 100 мл эфира и осаждают 720 мг дезфенилаланин В"-инсулина (свиньи), кристаллизующегося при рН 5,0 - 5,5. обработку трифторуксуснгой кислотой можно проводить в течение 10 лгггн при 50 С илч в течение 5 лгик с флегмой.еП р и м е,р 2. Аналогично примеру 1 из 1 г инсулина крупного рогатого скота получают 710 ягг дезфенилаланин В-инсулина (крупного рогатого скота).,П р и м е,р 3. Как в примере 1 из 1 г инсулина крупного рогатого скота, проводя процесс в течение 50 час при 5 С в 85%-ном пиридине, получают 695 мг дезфенилаланин В-инсулина (крупного рогатого скота).П р и м е,р 4, Аналогично примеру 1 из 1 г ,инсулина свиньи при проведении реакции в Предмет изобретения Ткрагк ГгодиисиоеСовета .Министров СССРоткрытийнаб., д. 4/5