Способ получения ферментного препарата эластазы

282247 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУСова Советсиии Социалиатичеаили РевпублииКл, С 126 13/1 С 12 д 9/00 1244222/28-13) аявлено 29.Ч.1968 с п единением вкиКомитет по делам аобретений и открытий ари Совете Министров СССР, А. Рассул ганической химии им. Н. Д. Зелинского 3 аявител сти 2 алицилово" хающем катионите на основе с и кислоты и фенола,Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.Для посева используют посевной материал первой генерации. Длительность выращивания посевного материала составляет двое суток. Ферментацию проводят при температуре 26 - 28 С в первые сутки, затем при температуре 30 - 32 С, рН среды не регулируется, изме. няясь в процессе ферментации от % до 7,3 в начале с последующим падением до рН 6,0 - 6,5, Продолжительность ферментации составляет 5 - 6 суток. Необходимым условием выращивания является активное аэрирование культуры стерильным воздухом, Весь процесс культивирования ведется в стерильных условиях. Для выращивания Ас 11 потусез ггпозцз может быть использована среда, например, следующего состава, оо:Крахмал 6 Мука соевая 2 Сульфат аммония 0,45 Кукурузный экстракт 1,5 Кальций углекислый 0,8 Через колонк КБ-2 пропуска Ас 11 потусез гппо но удаляют фильс ионообменн ют культуральну зцз. Мицелий пр рованием или це ои смолои ю жидкость едварительнтрифугиро. висимое от авт. свидетельс СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНО Изобретение относится к области получения ферментного препарата эластазы - фермента, способного гидролизовать белок эластин, вызывая при соответствующих условиях полное его растворение в водных средах, 5Известен способ получения эластазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим отделением мицелия и выделением ферментов из 10 культуральной жидкости. Однако применение этого способа ограничено в промышленности из-за его высокой стоимости, длительности процесса и недостаточной активности препарата. 15 Цель изобретения - повышение чистоты и активности ферментного препарата. Для этого в качестве продуцента используют микроорганизм Ас 11 потусез гппозцз, являющийся одно временно продуцентом окситетрациклина, который накапливается, главным образом, в мицелии. Актиномицент АсЫпогпусез гппозцз продуцирует в культуральную среду активные ферменты с эластазными свойствами. Подоб ное свойство АсЫпотусез гппозцз характерно в основном для двух штаммов ЛСТ-гибрид и ЛСТ. Выделение эластазы из культуральной жидкости осуществляют при помощи ионообменной смолы КБ-2 - сильнонабу РЕПАРАТА ЭЛАСТАЗЪ282247 Полищук Корректоры: Е. Усова и Т, Бабакина Заказ 535/3 Изд. Мо 199 Тираж 448 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр, Сапунова, 2 ванием. Вместе с мицелием удаляется основное количество окситетрациклина, который вдальнейшем извлекается известным путем,В исходной жидкости после отделения мицелия остается неочищенная эластаза и часть 5окситетрациклина, который перешел в раствор,в процессе ферментации. Остаточная концентрация его составляет 600 - 1000 ед/мл,При пропускании культуральной жидкостичерез колонку одновременно происходит сорб. 10ция антибиотика и эластазы, Часть неактивных белков проходит не сорбируясь на смоле.Колонку после окончания сорбции промывают слабым аммиачным буфером рН 9,2 м дляудаления пигментных веществ. После промывки эластазу элюируют с колонки концентрированным раствором аммиачного буфера,содержащего хлористый натрий, хлористыйаммоний и аммиак рН 9,2 - 9,3. При этомвесь окситетрациклин из культуральной жидкости и большая часть балластных белков остается на смоле, а эластаза переходит в раствор элюата в очищенном виде. После такойобработки чистота эластазы возрастает,в 10 -15 раз. 25Таким образом, на смоле в одну стадиюпроизводится концентрирование эластазы иочистка ее от антибиотика, большей части пигментов и балластного белка,Из элюата, представляющего собой концен- З 0трированный раствор солей и ферментов, эластазу выделяют осаждением тремя объемамиизопропилового или этилового спирта при температуре 0 С. Выпавший осадок ферментацентрифугируют или фильтруют, растворяют З 5в небольшом количестве воды и лиофильновысушивают.Пример получения эластазы из культуральной жидкости Ас 11 погпусез гппозцз. Через колонку размером ЗК 25 см, уравновешенную 40/гз м фосфатным буфером рН 6,3, пропускаютпри 4 С 6000 мг культуральной жидкости Ас 11 погпусез г 1 гпозцз, содержащей 88 г белка поЛоури и 5,4 г окситетрациклина. Сорбируется96/, протеолитической активности и 94% 45эластазной активности от исходной, а также56 г,белка по Лоури и 5,0 г окситетрациклина,Колонку промывают 700 мл аммиачного буфера рН 9,2 состава 0,005 МНС 1 - МНз, С промывными водами выходит часть пигмента и 50около 2 о/о белка,Эластазу элюируют 600 мл концентрированного буфера состава 1 м КаС 1 - О,ЗМ 1 х 1 Н 4 С 1 -ХНз, рН 9,2 - 9,3 со скоростью около 50 мл/час,Выход 6,7 г белка по Лоури (7,6%). 55 Составитель Г. Редактор Н. Воликова Техред Л. ЕвдоновПрактически весь окситетрациклин остается на колонке, Элюат охлаждают до 0 - ( - 5 С) и при перемешивании добавляют 1800 лл охлажденного до - 10 С изопропанола или этанола. Осадок центрифугируют через час при 3000 об/мин, растворяют в 60 мл охлажденной дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Выход сухого препарата эластазы составляет около 2,0 - 2,5 г, Выход активности - около 40 - 45%.Характеристика эластазы Ас 11 погпусез игпозцз.Внешний вид - порошок светло-кремового цвета.Активность 1 мг эластазы полностью растворяет (видимое растворение) 150 мг эластина на 1 час при температуре 40 С.Оптимум рН эластазной активности. Максимальное действие на эластин проявляется при рН 8,8, а также при рН 6,4 в 0,03 - 0,05 М трисовом или глициновым буфере.Устойчивость при различных рН. Препарат эластазы устойчив в пределах рН 5,5 - 8,5 при нагревании в течение часа при 40 С в буфере соответствующего рН.Протеолитическая активность, Препарат эластазы обладает заметной способностью гидролизовать другие белки, например казеин. Его протеолитическая активность по казенну соответствует 25 - 30)(10-з мэкв, тирозина, освобождаемого за 1 мин гидролиза казеина при 40 С в расчете на 1 мг фермента. Максимальное действие на казеин наблюдается при рН 7,1.Растворимость. Препарат полностью растворим в воде и солевых растворах. Предмет изобретения1. Способ получения ферментного препарата эластазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим отделением полученных клеток продуцентов и выделением ферментов из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и чистоты ферментного препарата, в качестве продуцентов используют Ас 1 гпогпусез г 1 гпозцз, являющийся одновременно продуцентом антибиотика окситетрациклина, а выделение эластазы из культуральной жидкости осуществляют при помощи ионообменных смол.2. Способ по,п. 1, отличающийся тем, что в качестве ионообменной смолы используют катионит КБ-2.