Способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных

01 О,ЕИЗ ЕНИ об по ДЯ спос а кле ти и ба явля ок-доно надежн зароды ия визу еток по тс ро ст ания веде ГОСУДАРСТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИС НИ ОБРЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ ЬСТВУ(56) Е 111 п 9 ег М,Я. ТЬе се 11 сусе апб 1 гапзратьоп о 1 Ьаз 1 о 1 а пос 1 е 1 п ВовЬпа огеп 1 а 3//Оече 1 ор. Во 1 1978, ч, 65, р. 81 - 89,Вегопбп 9 еп С,Н. ТЬе бечеорвеп 1 а ро 1 еп 11 а 1 от зупсЬгоп 1 геб аврЬЬ 1 ап се 11 пос 1 е//Оечеор. Во 1, 1981, ч, 81, р. 115 - 126.Оогбоп,1,Ваз 1 еу К.А., йеечез ОЯ, ТЬе бечеорвепта саразТу о 1 пос е Тгапзр 1 аптеб 1 гов Еега 1 игеб зЬп сеИз о 1 або 11 фгопдз//,. ЕвЬгуо 1. ехр. МогрЬ, 1975, ч. 34, р. 93 - 112.Костомарова А.А. Вьюн.//Объекты биологии развития, М,:Наука, 1975, с, 308 - 323.Хунг Н,МГазарян К.Г. Пересадка соматических ядер в активированные яйца костистых рыб (на примере вьюна Мз 9 огпоз 1 озз 3 1,).// Онтогенез, 1978, т,9, М 1, с, 85-90. Изобретение относится к способам генной инженерии и разведения рыб, культивирования или сохранения тканей и живых клеток и может быть применено в селекции и выведении новых пород рыб, в практике исследований по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, а также в фундаментальных и прикладных экспериментально-эмбриологических исследованиях, имеющих в своей основе метод трансплантации ядер зародышевых и соматических клеток в яйцеклетки,Известен способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, предусматривающий ведение клеточных культур(54) СПОСОБ ОТБОРА КЛЕТОК- ДОНОРОВ ЯДЕР У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ (57) Использование: селекция и выведение новых пород рыб, исследования по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, фундаментальные и прикладные экспериментально-эмбриологические исследования, Сущность изобретения: зародыши костистых рыб на различных стадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек, диссоциируют на отдельные клетки в бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров ядер по стадиям митотического цикла. эмбриональных или дифференцирован соматических клеток и синхронизацию и стадиям митотического цикла,За прототип может быть выбран спо отбора клеток-доноров ядер у низших звоночных, который заключается в том берут клетки эмбрионов амфибий и выв их в монослойную клеточную культуру. Целью предлагаемого упрощение способа отбор ядер и, повышение точнос метода за счет использо костистых рыб, а также про ной идентификации и отб диям митотического цикла1761798 Результаты экспериментов по трансплантации ядер, находящихся на различных стадиях митотического цикла, в неоплодотворенные яйцеклетки вьюна) Развития нет Поставленная цель достигается тем, чтозародышей костистых рыб на различныхстадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек известным микрохирургическим методом, диссоциируют на отдельные клеткив бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию иотбор клеток-доноров по стадиям митотического цикла.Использование зародышей костистыхпозволяет сразу после диссоциации зародыша на отдельные клетки производить визуальную идентификацию и отборклеток-доноров ядер непосредственно передопытом под контролем светооптических приборов. Это существенно упрощает способ.Визуальный отбор позволяет использовать клетки на единственно возможных дляопыта стадиях цикла, что повышает точность метода. Отказ от предварительноговывода клеток в культуру предохраняет отпоявления в опыте различных аномалий,Предлагаемый способ реализуется следующим образом,П р и м е р 1, Зародышей вьюна освобождают от оболочек двумя остро заточенными препаравальными иглами идиссоциируют на отдельные клетки в.бескальциевом физиологическом растворе дляхолоднокровных в течение 10 минут прикомнатной температуре. После этого предметное стекло с каплей раствора, в которойнаходятся клетки, помещают в поле зрениябинокулярного микроскопа с общим увеличением 16 х - 32 х и отбирают клетки с округлым тонко оконтуренным ядром на стадиипоздней интерфазы клеточного цикла, после чего ядра трансплантируют в неопло 5 дотворенные искусственноактивированные водой яйцеклетки вьюнапо соответствующей методике (5). Дробление яйцеклеток-реципиентов происходит в100 случаев (см. табл, 1).10 П р и м е р 2, Опыт проводят по схеме,как в примере 1, но диссоциацию клетокведут в течение 20 мин и отбирают клетки, вкоторых ядра имеют более четко прорисованный утолщенный контур. соответствую 15 щий стадии профазы клеточного цикла, итрансплантируют их в яйцеклетки-реципиенты по той же методике (5), Дроблениеяйцеклеток-реципиентов происходит в100 случаев (см. табл, 1).20 Формула изобретенияСпособ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, включающий использование зародыша низших позвоночных,обработку клеток бескальциевым раствором25 для диссоциации с последующим определением стадии митотического цикла, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощенияспособа, повышения его трчности и надежности, в качестве зародыша низших позвоноч 30 ных используют зародыши костистых рыб, аопределение диссоциированных клеток настадиях поздней интерфазы и профазы митотического цикла с последующим отбором осуществляют визуально под контролем35 светооптических систем,