Способ определения иммунодефицитных состояний

, 1982, Вс 1 311,ИЯ ИММУНОД медицинееской иммуого статуспансеризания являет тся к инич мунн и ди брете ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) 2-й Московский госудцинский институт им. Н.И(56) Ргехеп 1 цз Е Аппа, СМ 4,354,(54)СПОСОБОПРЕДЕЛЕН ФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИИ (57) Изобретение относи может использоваться в кл нологии для оценки им больных и при проведени ции населения. Целью изо Изобретение может быть приме тод определения са больного. Цель изобрете шение точности с ния иммунодефи ванный на оценке факторам роста (и ной мембране. Способ осуще разом. Мононуклеар периферической к но из локтевой ве(10-25 ЕД/мл кро рованием на градотносится к медицине иено как лабораторный меммунологического стату ния - упрощение и повыпособа за счет определецитных состояний, осноэкспрессии рецепторов к нтерлейкинам) на клеточствляется следующим обые клетки из венознои рови, забранной стерильы и гепаринизированной и) выделяют центрифугииенте плотности фиколлся упрощение и повышение точности анализа. Способ определения иммунодефицитных состояний заключается в определении уровня экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинам) на поверхности иммунокомпетентных клеток с помощью хемилюминесцетного метода, Мононуклеарные клетки из периферической крови человека культивируют в течение 16 - 18 ч в присутствии митогена, затем определяют уровень активации этих клеток экзогенными интерлейкинами по сравнению с уровнем спонтанной хемиламинесценции в суспензии клеток в присутствии люминола, При иммунодефицитных состояниях отмечают резкое снижение активации хемилюминесценции интерлейкинами 1 и 2 (для интерлейкина18,50 и ниже, для интерлейкина17 и ниже),верографина по методу Всуе. Мононуклеарные клетки культивируют в среде В 199 (Ин-т полиомиелита и вирусного энцефалита) н концентрации 1-2 х 10 мл с ФГА или КОН-А ("Сэрва", ФРГ) в дозе 5-10 мкг/мл при 37 С в течение 14 - 16 ч в центрифужных пробирках, После культивирования клетки центрифугировали при 500 С. Надосадок удаляли и клетки ресуспендировали в 0,1 мл среды % 199, Суспензию клеток переносили в кювету, содержащую 0,8 мл среды инкубации следующего состава: 110 мМ йаС 1, 5 мМ глюкозы, 2,5 мМ М 9 С 12, 0,65 мМ люминала, 10 мМ трис НО, рН = 7,4. Определяли уровень спонтанной хемилюминесценции с помощью люминометра (ЛКБ, Швеция). Не нарушая светоизоляции системы, в кювету5 10 15 20 25 30 35 40 50 добавляли 0,1 мл среды, содержащей интер- лейкинили интерлейкин, и определяли уровень активированной хемилюминесценции. Вычисляли отношение величин ак 1 а1 сптивированной и спонтанной хемилюминесцении (индекс активации), Индексы активации, характерные для здоровых доноров и для больных с иммунопатологическими состояниями подтверждают изобретение. Иммунодефицитные состояния были, диагносцированы известным способом.. Интерлейкини интерлейкинполучали иэ среды культивации мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров. Мононуклеарные клетки разделяли на прилипающие и неприлипающие к стеклу культивацией в пенициллиновых флаконах в концентрации 2-4 х 10 /мл с 20 оь-ной эмбриональной телячьей сыворотки при 37 С в течение 45 - 60 мин, Неприлипшие клетки переносили в новые флаконы. Прилипшие клетки снимали холодным раствором Версена (4 - 6 С), центрифугировали и ресуспендировали в среде М 109. Для получения среды, содержащей интерлейкин, прилипающие клетки культивировали в концентрации 0,2 - 0,4 х 10 /мл в среде М 199 с 10 О-ной эмбриональной телячьей сыворотки. Через 72 ч надосадак собирали и хранили при - 20 С. Для получения супернатанта, содержащего интерлейкин, неприлипающие клетки в концентрации 1 х 10 /мл культивировали в среде М 199 с 10 ОД-ной эмбриональной телячьей сыворотки и с 10 мкг/мл ФГА. Через 72 ч надосадок собирали и хранили при - 20 С, При выполнении способа возможно использование коммерческих препаратов интерлейкинаили интерлейкина,П р и м е р 1. Больной Б., 36 лет поступил в отделение рекоструктивной хирургии глаза ВНИИ ГБ МЗ СССР с жалобами на жгучие боли в правом глазу,.светобоязнь и ухудшение зрения, При обследовании было выявлено, что роговица инфильтрирована, прозрачность нарушена, имеется множество пузырьков высыпаний. Был диагностирован герпетический кератоувеит в стадии обострения заболевания, На основании длительного рецидивирующего течения заболевания было сделано предположение, что у больного имеет место иммунодефицитное состояние, усугубляющее течение заболевания. Для параллельного проведения оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного была забрана кровь. При использовании предлагаемого способа по снижению индекса активации хемилюминесценции интерлейкиномдо 10,2%, интерлейкиномдо 9,10 было диагностировано им-" мунодефицитное состояние через 18 ч после забора крови. Через 80 ч эти данные были подтверждены с помощью известного способа оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам.П р и м е р 2. Больной И., 26 лет, поступил в радиологическое отделение МНИ РРИ с жалобами на опухолевидные образования в области шеи, лихорадку, плохое самочувствие. При объективном обследовании в области шеи, подмышечных впадин пальпируются уплотненные пакеты лимфоузлов. При биопсии обнаружены клетки Березовского - Штернберга, йа основании чего был поставлен диагноз лимфогранулематоза. Для оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного была забрана кровь. При использовании данного способа у больного было диагностировано иммунодефицитное состояние по снижению индекса активации хемилюминесценции до 15 О для интерлейкинаи до 17 для интерлейкина. Результаты были получены через 18 ч после забора крови. Полученные результаты были подтверждены с помощью известного способа через 80 ч после взятия крови. Таким образом; диагностика иммунодефицитного состояния была сокращена на 62 ч.П р и м е р 3. Больной Г., 6 лет, находился на лечении в детской клинической больнице М 10 г, Москвы. Жалоб не предьявлял. Объективно - признаки болезни Дауна. Поступил по поводу длительной вялотекущей болезни верхних дыхательных путей, При оценке экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного было диагностировано иммунодефицитное состояние. При параллельной оценке экспресии рецепторов предлагаемым способом было также диагностировано иммунодефицитное состояние по снижению индекса активации хемилюминесценции интерлейкиномдо 18,5 О, интерлейкиномдо 14,2 О. Срок диагностикибыл также сокращен на 62 ч.Таким образом, предлагаемый способ обладает рядом преимуществ по сравнению с известным ранее способом диагностики иммунодефицитных состояний: меньшей трудоемкостью и длительностью (сокращение срока постановки диагноза на 62 ч), высокой точностью и воспроизводимостью(значение индекса активации, вычисленное по данным хемилюминесцентного метода, колеблется в пределах 2 - 5 О/ в пяти параллельных пробах), отсутствием необходимости дорогостоящих меченых реактивов, прогрессивностью (использование современного высокочувствительного метода биофизического анализа).1654748 Формула. изобретения Составитель П.БонарцевТехред М. Моргентал Корректор С.Черни ,Редактор В.Данко Заказ 1948 Тираж 420 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Способ определения иммунодефицитных состояний путем активации мононуклеарных клеток крови с помощью интерлейкинаили интерлейкинас последующей оценкой митогенного действия на клетки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа,дополнительно леред активацией интерлейкинами мононуклеарные клетки культивируют 16-18 ч вприсутствии митогенэ, далее сравнивают уровень активации митогенами 5 и интерлейкинами с помощью хемилюминесценции и при снижении хемилюминесценции с интерлейкиномдо 18,5 и ниже и интерлейкиномдо 17 и ниже определяют иммунодефицитное состояние, 10