Способ определения антистрептокиназы

, 174272 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) 01 М 33/53 ЗОБ ИСАНИ ЕТЕН ЛЬСТВУ АВТОРСКОМ И ледовательоток и Госувательский роля биолоаратов им,М,Постникова, . Л.К,Берестовая ию стр лей сух птокий, М.,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Инструкции по примененназы для диагностических це1987. Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения антистрептокиназы в сыворотке крови и медикобиологических и репаратах.Целью изобретения является повышение точности способа.Способ осуществляют следующим обраБерут кровь, выделяют ее фракции и инкубируют со стрептокиназой, В качестве фракции используют сыворотку. которую инкубируют со стрептокиназой, иммобилизированной на плазминогене, Активность антистрептокиназы устанавливают в сравнении со стандартом с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА),При осуществлении способа ИФА проводят на планшете, который предварительно модифицируют плазминогеном. после чего последовательно наносят стрептокиназу, анализируемую пробу и специфический(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИСТРЕПТОКИНАЗЫ(57) Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения антистрептокиназы в сыворотке крови и медикобиологических препаратах. Цель изобретен ияв повышение точности способа. Сущность; способ предусматривает забор крови, выделение сыворотки и инкубирование со стрептокинаэой, иммобилизованной на плазминогене, и втвердофаэном иммуноферментом анализе устанавливают активность антистрептокиназы по сравнению с контролем; По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 5 - 10 раз. иммунореагент, по степени свторого с антистрептокиназой сдержании,П р и м е р. В лунки полистироловыхпланшетов для ИФА вносят по 200 мкл плаэминогена в концентрации 5 мкг/мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ)следующего состав;. мас,%:Хлористый натрий 0.8Фосфорнокислый однозамещенный калий 0.02Фосфорнокислый двузамещенный 12-водныйнатрий 0,29Хлористый калий 0.02Дистиллированнаявода ОстальноерН 7,3,Сенсибилизирэванные планшеты инкубируют при 6 С в учение 20 ч. после чегоратно отмывают от непрореагировавшелазминогена этим же буфером.1742726 50 Составитель Г, КрюковаТехред М.Моргентал Корректор Т, Палий Редактор В, Петраш Заказ 2281 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Далее планшеты обрабатывают раствором стрептокиназы, Для этого в лунки планшетов вносят по 200 мкл раствора диагностической стрептокиназы в ФСБ при концентрации стрептокиназы 5 МЕ/мл и инкубируют при 37 С в течение 1,5 ч, Затем планшеты 3-кратно отмывают от непрореагировавшей стрептокиназы ФСБ, дополнительно содержащим 0,5 О твина(ФСБ-Т),Связывание стрептокиназы с антистрептокиназой осуществляют с использованием разведенных ФСБ-Т 1;1000 контролируемых сывороток крови от трех пациентов (опыт), а также стандартных донорских сывороток с эталонами содержания антистрептокиназы 100, 300, 500 и 960 АЕ, В каждую лунку вносят по 200 мкл указанных проб, При этом для каждого определения используют по 3 лунки с усреднением результатовПланшеты инкубируют при 37 С в течение 1 ч, после чго 3-кратно отмывают с помощью ФСБ-Т, Далее в лунки вносят по 200 мкл специфического иммунореагента - антител диагностических против иммуноглобулина С человека, меченных пероксидазой хрена, инкубируют при 37 С в течение 1 ч, 5-кратно отмывают БСФ-Т и вносят в лунки при 200 мкл субстрата - раствора 5- аминосалициловой кислоты (5-АС), содержащего перекись водорода,Для приготовления субстрата 20 мг 5- АС растворяют в 20 мл дистиллированной воды, подогретой до 65 С, и добавляют 2,3 мл 30%-ного Н 202, разведенного из расчета 0,1 мл в 60 мл дистиллированной воды, Планшеты выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 450 нм,При фотометрировании иэ показаний фотометра вычитают фон (оптическую плотность Е 4 Бо) реакционной смеси, не содержащей антистрептокиназы, В результате длястандартных образцов с указанной активностью получают Еао, равные 0,17 + 0,03,5 0,30 -0,04, 0,44 +0,03 и 0,68 0,07 соответственно, по которым строят градуировочную кривую,Для контролируемых проб Е 4 ьо оказались равными 0,192 + 0,016, 0,344 + 0,009 и10 0,388 - 0,10. Из градуировочного графикаустановлено, что этим оптическим плотностям соответствуют следующие значенияантистрептокиназной активности (АЕ);136 + 11, 364 + 10 и 440 + 11, При опреде 15 лении антистрептокиназной активности техже проб известным способом получены значения 150 + 50, 400 + 100 и 200 + 100 АЕсоответственно.Таким образом, по результатам трех па 20 раллельных измерений ошибки среднихзначений в предлагаемом способе составили 10 - 11 АЕ, тогда как в известном ониравны 50 - 100 АЕ, т,е. результаты измерений в предлагаемом способе в 5 - 10 раз25 точнее.Формула изобретенияСпособ определения антистрептокиназы, включающий забор крови, выделениефракции и инкубирование со стрептокина 30 зой с последующим определением антистрептокиназы по сравнению с контролем,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности способа, в качествефракции крови используют сыворотку, при35 этом инкубируют ее со стрептокиназой, иммобилизированной на планшете, покрытомплазминогеном с последующим определением концентрации антистрептокиназы методом твердофазного иммуноферментного40 анализа.