Способ получения кожного трансплантата для дермопластики

(54) СПОСОБТРАНСПЛАНСТИКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР л, М 19иологической физики АН к; Т,Г. Григорьева, Т.И. Ниочев) идетельство СССР 12 М 5/00, 1987. ПОЛУЧЕНИЯ КОЖНОГО АТА ДЛЯ ДЕРМОПЛАИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для закры.тия раневой хирургии поверхности.Целью изобретения является повышение выхода конечного продукта.П р и м е р 1. Кожный трансплантат для экспериментальной дермопластики морской свинки (вес особи 200 г, на коже ее боковой поверхности под общей анестезией нанесен хирургический дефект на всю глубину кожной ткани величиной 2 х 3 см) готовят следующим образом.Смешивают 8 мл уксуснокислого раствора свиного кожного коллагена в концентрации 5 мг/мл с 1 мл 0,1 М йаОН, 1 мл среды Игла десятикратной концентрации, 110 тыс. клеток лейкоцитарной части крови реципиента - морской свинки (из расчета 10 тыс. клеток на 1 мл окончательной смеси) и 1 мл водного раствора хондроитинсульфата концентрацией 0,8 мг/мл. Полученную смесь быстро перемешивают, выливают в пластмассовую чашку Петри диаметром(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хирургии для закрытия раневой поверхности, Цель - повышение выхода конечного продукта, Кожный трансплантат для дермопластики получают путем смешения раствора уксусно- кислого коллагена с клетками с последующим нанесением на подложку эпидермоцитов реципиента. При этом дополнительно смешивают раствор уксуснокислого коллагена с клетками с гликозаминогликаном, а в качестве клеток используют лейкоцитарную часть крови реципиента или одногруппного донора. 60 мм и выдерживают в термостате при 37 С в течение 20 мин. После образования колла- генового геля толщиной 0,5 см отделившуюся от него жидкость сливают, на верхнюю сторону геля наносят предварительно полученные эпидермоциты реципиента в количестве 10 тыс, жизнеспособных клеток на 1 0 ф см поверхности геля, суспендированные в ОЧ2 среде Игла, модифицированной Дальбекко, с добавлением 100/,-ной эмбриональной сы- а воротки коров. Весь полученный таким об- ф разом кожный трансплантат заливают питательной средой Игла, модифицирован ной Дальбекко, с 10;-ной эмбриональной сывороткой коров.Эпидермоциты для этих целй выделя-ф ют следующим образом, Кожу перед взяти- ) ем образца протирают спиртом, Взятый образец кожи обрабатывают смесью антибиотиков (пенициллин и стрептомицин в концентрации 1000 ед/мл, нистатин в концентрации 100 ед/мл) дважды в течение 15 мин, затем измельчают на кусочки объе 1650141дой Игла с 10-ной эмбриональнойсывороткой коров и ставят в термостэт на 37 С, В дальнейшем его используют для изучения взаимодействия лейкоцитов и 55 мом 1 - 2 мм, которые помещают в 0,2-ныйграствор трипсина. Кусочки кожи обрабатывают трипсином при 37 С в течение 30 мин при постоянном помешивании с помощью магнитной мешалки. Затем смесь немного 5 отстаивают, надосадочную жидкость сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют, Оставшиеся кусочки кожи вновь заливают свежим раствором трипсина и повторяют процедуру выделения эпидермоци тов 3 - 4 раза. Клетки, оставшиеся после центрифугирования в осадках, собирают вместе и суспендируют в питательной среде Игла, модифицированной Дальбекко, с 10 о -ной эмбриональной сывороткой ко ров, Затем определяют количество жизнеспособных эпидермоцитов путем прижизненного окрашивания образца клеток 0,2 -ным водным раствором трипанового голубого .и доводят концентрацию 20 клеток до 200 тыс. кл/мл питательной среды.Из полученного таким образом кожного трансплантата вырезают лоскут 2 х 2 см и помещают на раневой участок морской 25 свинки, при этом 1/3 (2 см ) этого участка остается непокрытой и служит контролем. Сверху накладывают асептическую повязку. Через 2 недели на участке, куда был наложен трансплантат наблюдается образова ние кожного покрова (без волос), На контрольном участке образуется сухой струп.П р и м е р 2. Для получения кожного трансплантата смешивают 10 мл уксусно кислого раствора свиного кожного коллагена в койцентрации 5 мг/мл, 1 мл 0,1 М ИаОН, 1 мл среды Игла десятикратной концентрации, содержащей 65 тыс. клеток лейкоцитарной части крови крысы (из расчета 40 5 тыс. клеток на 1 мл смеси) и 1 мл водного раствора гиалуроновой кислоты в концентрации 0,5 мг/мл, Полученную смесь выливают в пластмассовую чашку Петри диаметром 60 мм и выдерживают при 37 С 45 в течение 30 мин, После образования коллагенового сгустка (геля), сливают отделившуюся от него жидкость, э на поверхность сгустка наносят эпидермоциты крысы, полученные аналогично примеру 1, из расчета 50 1 тыс, жизнеспособных клеток на 1 см поверхности сгустка.Полученный кожный эквивалент помещают на резйновое кольцо; заливают среэпидермальных клеток с коллагеновым матриксом.П р и м е р 3, Для получения кожного эквивалента смешивают 10 мл уксуснокислого раствора кожного человеческого колла- гена в концентрации 5 мг/мл с 1 мл 0,1 М йаОН 1 мл питательной среды Игла десятикратной концентрации, содержащем 130 тыс,клеток лейкоцитарной части крови человека - препарат "Лейкот" (из расчета 10 тыс, клеток на 1 мл смеси) и 1 мл водного раствора гепарансульфата в концентрации 0,25 мг/мл. Коллагеновый гель из этой смеси получают, аналогично примеру 1, при этом смесь выдерживают в течение 40 мин. Затем на поверхность коллагенового сгустка наносят эпидермоциты человека, полученные аналогично примеру 1, из кусочков кожи человека, взятых при операции в количестве 1 тыс. жизнеспособных клеток на 1 см поверхности сгустка,Полученный трансплантат помещают на полупроницаемую мембрану "Миллипор,2" в проточную камеру при 37 С, где проток среды Игла, модифицированной Дальбекко с 10 оэмбриональной сыворотки коров, осуществляют снизу через мембрану. В дальнейшем полученный кожный трансплантат используют для изучения развития эпидермисап ч 1 тго, Длительность получения кожного трансплантата по предложенному способу составляет всего 20 - 60 мин (без учета времени выделения эпидермоцитов 2 - 3 ч) вместо 2 - 3 недель согласно прототипу. При этом надежность образования коллагенового геля, пригодного для манипуляций с ним, составляет 100 , в то время как вероятность образования сжатой колла- Геновой решетки с иммобилизованными в ней фибробластами составляет 30 - 500 изза неоднородности популяций фибробластов и связанной с этим их разной функциональной активностью.Формула изобретения Способ получения кожнаго трэнсплантата для дермопластики путем смешивания раствора уксуснокислого коллагена с клетками с последующим нанесением на подложку эпидермоцитов реципиента, о т л ич а ю щ и й с я тем. что, с целью ускорения получения и повышения выхода конечного продукта, дополнительно смешивают раствор уксуснокислого коллагена с клетками с гликозоаминогликоном в количестве 0,5 - 2,0% от сухого веса коллэгенэ, а в качестве клеток используют лейкоцитарную часть крови реципиентэ или одногруппного донора.