Способ получения изолированных алейроновых зерен растений риса

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК зс 50 А 01 6 7/00 ВС(цОщдИана.1(1 ф:;ИБОУЩ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(1) Краснодарский ордена Трудового Красного Знамени политехнический институт(56) 1. Суворов В. И, Структура, химический состав и формирование алейроновыхзерен семян клещевины и люпина, Автореф.дис. на соиск. учен. степени канд. биологических наук. М., 1973.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ АЛЕЙРОНОВЫХ ЗЕРЕН ЯО,1117013 А РАСТЕНИЙ РИСА путем обработки семян химическими реактивами и последующего выделения фракций алейроновых зерен, отличающийся тем, что, с целью сохранения нативного состояния и повышения чистоты получаемого материала, семена обрабатывают последовательно 9- 0%, 24 - 26% и 49 - 51%-ными растворами желатина в 5%-ном водном растворе глицерина при 35 - 37"С в течение 1,5 - 2,5 ч в каждом, готовят блоки путем заливки семян последним раствором с последующим уплотнением, а выделение фракции алейроновых зерен осуществляют при помощи резки готового блока.1117013 Составизель Е. ШкрадюкТехред И. Верес Корректор А. Т:.скоТираж 721 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРно делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушскаи наб., д. 4/5филиал ПГ 1 П Патент, г, Ужгород, ул. Проектнан, 4 Редактор Л. ЛосеваЗаказ 095/2 Изобретение относится к гистохимии и может быть использовано для определения нативных незафиксировнных и зафиксированных химических соединений в алейроновых зернах.В современных биохимических и гистохимических исследованиях эндоспермов рисовых зерновок большое внимание уделяется исследованию клеток внешнего слоя эндоспермов, состоящего из 1 - 6 рядов клеток, называемых алейроновыми. Однако в силу ряда особенностей строения эндоспермов и техники приготовления препаратов проведение тех или иных гистохимических реакций нельзя считать удовлетворительными.Известен способ выделения алейроновых зерен, По данному способу измельченные семена многократно последовательно суспендируются и центрируются со Смесью ацетона и четыреххлористого углерода. В результате многократного отделения осадка от надсадочной жидкости после каждого центрифугирования последовательно повышается плотность осадка - фракции, содержащей алейроновые зерна и клеточные стенки (плотность = 1,41). На последующих этапах центрифугирования надсадочные жидкости соединяются и после отделения центрифугированием клеточных стенок при 2200 .у в течение 10 минут получается фракция алейроновых зерен 1,В результате измельчения и многократйого применения органических растворителей тонкие субклеточные структуры, каКими являются алейроновые зерна, содержащие различные формы белка, ферментов и фитина, претерпевают необратимые изменения - белок частично или полностью денатурируется, а в результате механического воздействия цитоплазматические мембраны разрушаются. В результате выделения препарат загрязняется другими струк турными компонентами клеток, Подобные препараты алей роновых зерен не могут удовлетворить требованиям многих гистохимических реакций. Цель изобретения - сохранение натив- ного состояния и повышение чистоты получаемого материала.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения изолированных алейроновых зерен растений риса, семена обрабатывают последовательно 9 - 10%,5 10 15 20 25 30 35 40 45 24 - 26/о и 49 - 51%-ными растворами желатина в 5%-ном водном растворе глицерина, при 35 - 3 С в течение 1,5-25 ч в каж дом, готовят блоки путем заливки семян последним раствором с последующим уплотнением, а выделение фракции алейроновых зерен осуществляют при помощи резки го. тового блока.Пример. Из зерновки риса вырезают кусочки эндоспермы, содержащие алейроновый слой. Нарезанные кусочки переносят в 9 в 10%-ный раствор прозрачной жела- тины, приготовленной на 5%-ном водном растворе глицерина при 36 С на 1,5-2,5 ч, далее кусочки переносят в 25 о/,-ный раствор желатины (время и температура те же) и в 50%-ный раствор гкелатины на 1,5-2,5 ч при той же температуре. Затем кусочки помещают в бумажные ванночки, ориентируют их алейроновым слоем в нуж. ную сторону и уплотняют в 50 о/о-ном желатине при компактной температуре до нужной твердости (это оценивается эмпирически). Из полученных кубиков, содержагцих объект, вырезают бритвой нужные заготовки, приклеивают поливинилацетатным клеем (ПВА) или эпоксидной смолой к деревянным колышкам, устанавливают блок перпен дикулярно алейроновым слоям к стеклянному ножу льтурамикротома и режут.Выкрошившиеся алейроновыс зерна собирают йа поверхность жидкости сгекляпкого ножа и переносят на предметное стекло, смазанное тонким слоем белково-глицеринового клея. После высушиваиия при комнатной температуре препарат окрашивают и изучают в фазово-ковграсгном микроскопе.Положительный эффект достигается тем, что нативность алейроновь.х зерен, полученных по предлагаемому способу, обеспечивается мягкими условиями заливки без применения полярных органических растворителей и высоких темгератур, а также т"м, что стенки клеток алейронового слоя одревеснены и желатина не проникает внутрь клеток, в то время как остальные ткани зерновки прэпи ываются хорошо. Связь между алейроновыми зернами ослабевает до такой степени, что в процессе механического воздействия режуп 1 ей кромки стеклянного ножа, алейроновые зерна повреждаясь выкрашиваются на поверхность жидкости в ванночку стеклянного ножа в чистой фракции.