Способ определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения

(5 ОПИСАНИЕ ЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ И н ом,леч олб 8 м довод в табл рокси после дят до ГосудАРственный комитетПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(46) 15.07,91. Бюл. М 2671) Курский государственный медицинскийинститут(54). СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАНИЛАМИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОБЪЕКТАХБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ(57) Изобретение относится к медицине иможет быть использовано при проведенииклинических, химико-токсикологических исудебно-химических исследований. С целью Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований.Целью изобретения является повышение точности способа определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения.Способ осуществляют следующим обра 0 мл анализируемого кислотного, изния иэ ткани органа вносят в мерную емкостью 50 мл, затем вносят в колбу л 40 ф-ного раствора едкого натра и ят рН смеси до значения, указанного .2 (графа 3). раствором 10-ного гидда натрия, добавляя его по каплям, чего уровень жидкости в колбе довометки дистиллированной водой.мл крови, исследуемой на содержание аниламидного препарата, вносят в повышения точности исследования сульфаниламидные препараты изолируют из обьектов биологического происхождения с помощью водного раствора кислоты. Полученное кислотное извлечение подвергают сорбционной очистке на микроколонках с полиамидным сорбентом от зндогенных веществ, способных образовывать азокрасители, а при проведении фотометрического исследования в качестве раствора сравнения используют смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки и всех ре/агентов, причем азокомпонент добавляется в реакционную смесь после приведения ее рН к значению в интервале 10,10-12,25 100- ым раствором гидроксида натрия. 9 табл. центрифужную пробирку и прибавляют туда же 10 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и через 5 мин в пробирку при перемешивании вносят 5 мл раствора 4 н, хлорной кислоты, содержимое пробирки центрифугируют при 500 д в течение 5 мин. Центрифугат переносят в мерную колбу на 50 мл. Осадок в центрифужной пробирке еще дважды обрабатывают аналогичным способом раствором 1 н, хлорной кислоты порциями по 10 мл. К объединенным в мерной колбе емкостью 50 мл центрифугатам прибавляют 3,8 мл 40 ф 4-ного раствора едкого натра и после перемешивания доводят рН раствора до значения, укаэанного в табл.2 (графа 3), раствором 100-ного гидроксида натрия, добавляя его по каплям, после чего общий объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.5 мл исследуемой мочи вносят в мерную колбу емкостью 50 мл и обьем жидкости в1663516 20 19 Продолжение табл. 8 4 Этаэол Таблица 9.Определение содержания сульфаниламидных препаратов в незатравленйсй моче ( в.контрольном опыте) Составитель В, Миташедактор А. Лежнина Техред М.Моргентал ектор В. Гирня каз 2262 Тираж 411 Под ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и 113035, Москва, Ж, Раушская наб., писноеоткрытиям при ГК зводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина. 101 1 4000 2 4000 3 4000 4 4000 5 4000 3733 3820 3733 3643 3643 93,33 95,50 93,33 91,06 91,06 Х = 92,86С =- 1,85СЬ 0 831 м2,30А 2,48М 92,85 ф 2,30колбе доводят до метки буферным раствором с соответствующим значением рН (табл,2, графа 3),В четыре подготовленные микроколонки с полиамидным сорбентом вносят одинаковые, точно отмеренные обьемы подлежащей очистке биовытяжки (но не более, чем указано в табл,2, графа 4), обработанной по методике, описанной выше. Микроколонки центрифугируют в течение 3-5 мин при центробежном ускорении 300- 5009, при котором скорость истечения ценрифугата в приемник составляет около 1 мл/мин. После центрифугирования приемники освобождают от центрифугата и приступают к промывке колонок буферными растворами с соответствующим значением рН (табл,2, графа 3), трижды внося их в микроколонки в объемах, указанных в табл.2 (графа 5). После внесения необходимых объемов буферных растворов проводят центрифугирование микроколонок в режиме, описанном выше. Полученные в приемниках центрифугаты отбрасывают, После проведения промывки микроколонок приступают к элюированию с них исследуемого сульфаниламидного препарата. С этой целью в микроколонки вносят буферный раствор с рН 11 в обьемах, указанных в табл,2 (графа 7), и трижды их центрифугируют, Полученные с четырех колонок элюаты собирают в мерную колбу емкостью 50 мл. Общий объем жидкости в колбе доводят до метки дистиллированной водой. После перемешивания раствор используют для определения в нем содержания сульфаниламидных поепаратов.Для этого в четыре мерные колбы емкостью 25 мл вносят 0,05-10,0 мл полученного раствора, после чего к содержимому колб прибавляют по 1 мл 4 н. соляной кислоты и в первые три колбы по 1 мл 0,2%-ного водного раствора нитрита натрия, После перемешивания в течение 15 с туда же добавляют по 1 мл 0,2%-ного спиртового раствора З-а, у-дикарбоксипропилроданина, После перемешивания в колбы поочередно добавляют 10 -ный раствор едкого натра в объеме, достаточном для получения при перемешивании отчетливого розово- красного окрашивания (рН растворов должна находиться в пределах, указанных в табл.2), аналогичное количество 10%-ного раствора едкого натра вносят в четвертую колбу и после перемешивания туда добавляют 1 мл 0,2 -ного водного раствора нитрита натрия, 1 мл 0,2%-ного спиртового раствора З-а, у-дикарбоксипропилроданина, После перемешивания в течение 15-20 с обьем жидкости в колбах доводят дистиллированной водой до метки.Определение оптической плотности окрашенных растворов азороданинов прово 5 дятс помощью фотоколориметра КФКприсветофильтре с Аэфф. = 490+10 нм в кюветес толщиной рабочего слоя 50 мм. В качествераствора сравнения используют раствор,полученный в четвертой мерной колбе.10 Содержание сульфаниламидных препаратов в пробах рассчитывают по соответствующим калибровочным графикам,Для построения калибровочных графиков в мерные колбы емкостью 25 мл вносят15 по 0,01, 0,05. 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 мл стандартного раствора препарата в 1,0 н. соляной кислоте с концентрацией 100 мкгlмл,недостающее до 1 мл количество 1 н. соляной кислоты и по 1 мл 0,14-ного водного20 раствора нитрита натрия, Через 15 с в колбыдобавляют по 1 мл 0,1%-ного спиртовогораствора З-а, у-дикарбоксипропилроданина. После тщательного перемешивания общий обьем жидкости в колбах доводят до25 метки смесью,05 М растворатетрабората натрия и 0,1 н. раствора гидроксида натрия (1:2,95). После перемешиваниясодержимого колб производят измерениеоптической плотности окрашенных раство 30 ров азороданинов с использованием фотоколориметра КФКв кювете с толщинойрабочего слоя 50 мм при светофильтре сдлиной волны кафф = 490+10 нм.Светопоглощение во всех случаях под 35 чиняется закону Бугера-Ламберта-Бера впределах концентраций 1-40 мкг препаратав 25 мл конечного объема. В качестве раствора сравнения в данном случае используют смесь вышеперечисленных реактивов.40 Количественное содержание сульфаниламидных препаратов в исследуемых образцах рассчитывают по следующим формулам:при определении содержания сульфаниламидных препаратов в тканях органов и45 15,625 С Чобщгде Х - содержание сульфаниламидного препарата (мкг) в навеске ткани органа, взятой на исследование;50 С - количество(мкг) сульфаниламидногопрепарата, найденное по соответствующему калибровочному графику; Чобщ - общий обьем (мл) кислотного извлечения, полученный из навески ткани органа;Чк - обьем исследуемого раствора (мл),нанесенный на одну микроколонку;/с - обьем конечного раствора (мл), взятый на проведение одного анализа, 1663516при определении содержания сульфаниламидных препаратов в крови и мочеХ 125 СВ где Х - содержание сульфаниламиднопрепарата в крови или моче (мкг/мл);С - количество (мкг) суд ьфанил амидго препарата, найденное по соответствущему калибровочному графику;Ч - объем исследуемого раствора (мнанесенный на одну микроколонку,Чс - объем конечного раствора (мл), втый на проведение одного анализа,Подготовка микроколонок для работОчистку полученных вытяжек из тканорганов, крови и подготовленных к аналипроб мочи осуществляют методом сорбцна полиамидном сорбенте (ТУ 6-09-1-8273. л),Я)Микроколонка представляет собой 20 трубку длиной 65-70 мм с внутренним диаметром около 13 мм, запаянную с одного конца перфорированной перегородкой, Для изготовления микроколонки на перфорированную перегородку кладут пористый диск 25 из фильтровальной бумаги, после чего в колонку вносят необходимое количество (табл,2, графа 2) сухого сорбента и сверху помещают еще один пористый диск из фильтровальной бумаги. затем слой сорбен та в микроколонке уплотняют поршнем от того же шприца, Поверх пористого диска из фильтровальной бумаги помещают прижимное кольцо с наружным диаметром 13 мм и внутренним диаметром 10 мм, Приемник 35 представляет собой стеклянную пробирку длиной 45-55 мм с внутренним диаметром около 13 мм.Хроматографическая микроколонка соединяется с приемником куском клейкой 40 ленты размером 15 х 30 мм.Перед работой микроколонку дважды центрифугируют с 960 -ным этиловым спиртом (порциями по 3-5 мл), после чего ее дважды промывают буферным раствором с 45 необходимым значением рН (табл.2, графа 3) порциями по 3-5 мл, после такой подготовки микроколонка готова к работе, Для проведения анализа желательно готовить новую колонку. Бывшие в употреблении ко лонки можно использовать до трех рэз, подвергая их регенерации, для этого микроколонки трижды центрифугируют с порциями по 3-5 мл 96 -ного этилового спирта, после чего микроколонки дважды 55 центрифугируют с порциями по 3-5 мл буферного раствора с необходимым значением рН (табл.2, графа 3). Хранить микроколонки можно в сухом виде, подготавливая перед работой по методике, описанной выше.П р и м е р 1. Определение содержания сульфаниламидных препаратов в ткани печени.Свежую печень трупа человека, погибшего в результате травмы, мелко измельчают и по 100 г помещают в центрифужные стаканы емкостью 250 мл. В стаканы прибавляют по 40 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата с концентрацией 100 мкг/мл в буферном растворе с рН 7,4 и оставляют на сутки при комнатной температуре, периодически перемешивая, Параллельно проводят холостые опыты, По истечении 24 ч в стаканы прибавляют 80 мл 1 н, раствора хлорной кислоты. Содержимое стаканов тщательно перемешивают и центрифугируют при 5009 в течение 5 мин, Центрифугат сливают в химический стакан емкостью 1 л, а к твердому остатку в центрифужном стакане вновь прибавляют 80 мл 1 н. хлорной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в тех же условиях, Операцию изолирования проводят 6 раз, Общий объем объединенных вытяжек измеряют с помощью мерного цилиндра на 1 л. Около 50 мл полученного извлечения помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5009 в течение 10 мин, Из полученного безбелкового центрифугата отбирают 40 мл и далее поступают так, как описано выше.Результаты определения содержания сульфаниламидных препаратов в ткани печени (модельная смесь) приведены в табл.4.Как видно из табл.4, ошибка способа при определении содержания сульфаниламидных препаратов в ткани печени составляет 3,83-9,56 . Невысокие результаты (73,13%; 71,04 ), полученные для некоторых препаратов, связаны не с недостатками предлагаемого способа определения, а с ограниченными возможностями способа изолирования сульфаниламидных препаратов растворами кислот из биологических тканей,Для сравнения точности способов проведено определение содержания сульфэниламидных препаратов в контрольных опытах (т.е. в вытяжках из ткани печени, не затравленных сульфаниламидами)предлагаемым способом и способом, выбранным в качестве и рототипа (табл.5),Из табл,5 следует, что предлагаемый способ позволяет точно определить содержание сульфаниламидных препаратов в кислотном извлечении из биологической ткани. Использование способа. предусматривающегс непосредственное определение1663516 Таблица 1 Препарат Концентрация в иЗвлечении, мкг/100 мл Способ опреде- ления Норсульфазол Стрептоцид Этазол 150 15 О 100 100 200 200 Предлагаемый Прототип Предлагаемый Прототип Предлагаемый Прототипсульфаниламидных препаратов в кислотнойвытяжке по реакции образования эзокрасителя, не позволяет получить точных данных,что может привести к значительным ошибкам, особенно при судебно-химических исследованиях, так как даже в отсутствие впробе исследуемых препаратов данные анализа свидетельствуют о их наличии в анализируемом образце. Предлагаемый способпозволяет полностью устранить зти недостатки,П р и м е р 2. Определение сульфаниламидных препаратов в крови,В мерные колбы емкостью 100 мл прибавляют по 10 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата вбуферном растворе рН 7,4 с концентрацией400 мкг/мл, после чего в колбы добавляютцитратную кровь человека, доводя уровеньжидкости в колбах до метки, Содержимое 20колб тщательно перемешивают и инкубируют в течение 24 ч. По истечении указанногосрока отбирают пробы по 5 мл и далее поступают тэк, как описано выше.Результаты определения содержания 25-сульфэниламидных препаратов в кровипредставлены в табл,6.Ошибка способа определения сульфаниламидных препаратов в крови составляет0,69 -4,17 ф, 30Для сравнения точности предлагаемогоспособа и способа, выбранного в качестве,прототипа, было проведено определениесульфаниламидных препаратов в незатравленной крови. 35Результаты исследования представлены в табл,7.П р и м е р 3, Определение сульфаниламидных препаратов в моче,В мерные колбы емкостью 100 мл прибэвляют по 10 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата вбуферном растворе с рН 7,4 с концентрацией 400 мкг/мл, после чего в колбу добавляют свежую мочу человека, доводя уровень 45жидкости в колбах до метки. Содержимоеколб тщательно перемешивают и инкубируют в течение 24 ч,По истечении указанного срока отбирают пробы по 5 мл и далее поступают так, как описано выше,Результаты определения сульфанилэмидных препаратов в моче человека представлены в табл.8.Как следует из данных, приведенных в табл,8, ошибка способа определения составляет 2,18-4,12.Для сравнения точности предлагаемого способа и способа, выбранного в качестве прототипа, проведено определение содержания сульфаниламидных препаратов в образцах мочи, в которой отсутствовали определяемые препараты.Результаты определения представлены в табл.9.Данные, приведенные в табл.7 и 9, свидетельствуют о том, что использование способа, выбранного в качестве прототипа, не позволяет точно определять содержание сульфаниламидных препаратов в крови и моче, Использование предлагаемого способа позволяет полностью устранить зтотнедостаток.Результаты количественного определения сульфанилэмидных препаратов в извлечениях из биологического материалаКак следует из данных, приведенных в табл.1, абсолютная ошибка способа, выбранного в качестве прототипа, может достигать 45 , в то время как абсолютная ошибка предлагаемого способа не превышает 11 .Формула изобретения Способ определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения путем извлечения препарата из биообьекта кислотой, очистки, получения окрашенного раствора с азокрасителем и фотометрирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, вытяжку пропускают через колонку с полиамидным сорбентом, добавляют раствор гидроксида натрия до рН 10,1-12,85 и фотометрируют, используя в качестве раствора сравнения смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки всех реагентов. Найдено препа- Абсолютная рата, мкг/100 мл ошибка,о а о д о фЮР Эох сц ф Х М 1нхеохам мр, оа ц х1хйхр, 5 о9 Х (б Ц (ЧИбб -овод о аРхфоцо р ю Ф й и Э р 1 Ф Х Ю ео цх х р, х е о о ь.а 3ы Фох мВас инфоахо1663516 . Таблица 3 Интервалы значений рН, в пределах которых оптическая плотность азороданинов является максимальнойи стабильной Препарат Интервал значений рН 10,90 - 12,25 10,10 - 11,30 10,80 - 11,60 НорсульфазолСтр епто цидСульфален Сульфамонометоксин 10,80 - 12,00 10,90 - 11,65 Этазол ТаблицаОпределение содержания сульфаниламидных препаратовв извлечениях из ткани печени Внесено Ри/и МорФологическиехарактеристики препарата на 100 г ткани печени, мкг Норсульфазол Стрептоцид 3533 3251 3220 3416 3432 2 3 4 5 1 2 3 4 5 40004000400040004000 4000 4000 4000 4000 4000 Определено пре-парата в извлечении, мкг 3188 3059 2984 , 2882 2956 Обнаружено препарата в извлечении, 7 к внесенному 79,70 76)48 74,60 72,05 73,90 88,33 81, 28 80,50 85,40 85,80 Х = 75135С = 2,90Сх = 1,30Хь = 3 61А = 4,79М = 75,35+ 4,79 Й = 84,26С = 3,29Сх = 1,47= 4,08А= 4,84М = 84,264,081663516 14 Продолжение табл,45 Сульфален Сульфамонометоксин Этаэол Т а б л и ц а 5 Определение содержания сульфаниламидных препаратов в контрольных опытах предлагаемым способом Внесено препарата на 100 гткани печеНайдено препа- Найдено спората в вытяж- собом, выбранным ке, мкг в качестве про- тотипа п/п ни мкг 1 2 3 5 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 3821 3824 3967 3958 3896 2829 2749 3136 3130 2782 2847 3010 2672 2935 2743 1 0,002 0,00 3 0,00 4 0,00 5 0,00 95,50 95,70 99,17 98,95 97,40 70,73 68,73 78,40 78,25 69,55 71,18 75,25 66,80 73,38 68,58 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 97,37С =- 3,00Сх = 1,341 о,45 =- Зэ 74А =13,83М = 97134 + 3174 Х =- 73,13С= 5,63Сх .= 2,521 рщ = 6,99А =-9,56М = 73 ф 13 "ь 99 Х =- 71,04С = 3,44Сх = 1,541 а,9) .= 4 ф 28А = 6,02М = 71,03 + 4,28 976 т 17 8281 13 614,87 718,72 990,121663516 16 Таблица 6Определение содержания сульфаниламидных препаратов в кровичеловека В Внесено прела- Найдено прела Найдено препап/п рата на 100 мл рата, мкг рата, 7.крови, мкг Метрологическиехарактеристики Норсульфазол Стрептоцид Сульфален Сульфамонометоксин Зтаэол 1 4000 2 4000 Э 4000 4 4000 5 4000 1 4000 2 4000 3 4000 4 4000 5 4000 4000 2 4000 Э 4000 4 4000 5 4000 1 4000 2 4000 3 4000 4 4000 5 4000 1 40002 4000 3 4000 4 .4000 5 400918 1663516 Таблица 7 Определение содержания сульфаниламидных препаратов в незатравленной крови (в контрольных опытах) Внесено препаратов на100 мл крови,мкг Найдено способом,выбранным в качествепрототипа, мкг/мл Найдено препарата предлагаемым способом,мкг/мл Вп/п 1 0,00 0,00 2 0,00 0,00 3 0,00 0,00 4 0,00 0,00 5 0,00 0,00 Т а б л и ц а 8Определение содержания сульфаниламидных препаратов в мочечеловека Внесено препарата на100 мл мочи,мкг Уп/и Найдено препарата, мкг Найдено препарата, 7 Метрологическиехарактеристики Н орсульфа з ол 1 4000 2 4000 3 4000 4 4000 5 4000 Стрептоцид 3763 3671 363 3954 3954 1 4000 2 4000 3 4000 4 4000 5 4000 Сульфален 100,00100,000100,0098,0099,50 Сульфамонометоксин 1 4000 2 4000 3 4000 4 4000 5 4000 90,00 87,25 90,00 90,00 92,83 4000 4000 4000 4 40004000 4000 4000 4000 3920 3980 3858 3763 3762 3671 3763 3600 3490 3600 3600 3713 6,23 2,28 4,53 7,35 3,98 96,45 94,08 94,08 91,77 94, 08 94,08 91,78 94,08 98,85 98,85 Х94,09С .= 1,65Сх = 0,74А = 2,18М = 94,082,05 Х = 95,53С = 3,17Сх = 1,421 д- = 3,94А= 4,12и = 95,53 "3,94 Х = 99,50С = 1,33Сх = 0,771 ар = 2,11А = 2, 13М = 99,50 2,11 Х = 90,02С = 1,96Сх = 0,88Та,ч .= 2,44А =- 2,71И = 90,02 ф 2,44