Штамм trichoderma viride вниигенетика 1310, продуцирующий целлюлолитические ферменты

ШТАММ TRICHODERMA VIRIDE ВНИИГЕНЕТИКА 13/10, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ. Хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, регистрационный номер ЦМПМF 120.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к штаммам продуцентам ферментов, а именно к штамму Тrichoderma viride, синтезирующему ферменты целлюлозного комплекса.
Известен штамм Trichoderma viride 44 - продуцент целлюлолитических ферментов.
Известен также штамм Trichoderma viride ВНИИ генетика Б7.
Характерные признаки штамма-прототипа: на 4-е сутки роста на агаризованных средах образует компактные колонии диаметром 20-35 мм. Конидии желто-бежевого цвета, овальные, двух типов - крупные (d_е = = 6,30-0,13 , d_w = 4,3 0,34 ) и мелкие (d_е = 4,54 0,07 , d_w = 3,43 0,08 ). Процентное соотношение крупных и мелких конидий на 7 сутки роста составляет 13: 87 соответственно и не меняется с возрастом культуры. Штамм Б7 полностью разжижает желатину к 15-20 суткам роста, молоко пептонизирует к 7-10 суткам. Нитраты не восстанавливают вплоть до 30-ых суток инкубации. Максимальные уровни активностей целлюлаз в культуральной жидкости составляют:
С₁ активность - 200-250 мг/мл глюкозы (0,8-009 МЕ/мл)
С_х активность - 150-200 мг/мл глюкозы (27,7-37,3 МЕ/мл)
Гидролиз фильтровальной бумаги - 12-15 мг/мл глюкозы (1,1-1,3 МЕ/мл)
МЕ - международная единица целлюлолитической активности, равная М глюкозы/мин.
Определение активности проводили по методам Мандельс и Вебера "Cellulases and their Applications", adv. chem. Ser. 95, 1969, 391.
Недостатком штамма ВНИИгенетика Б7 является низкий уровень целлюлолитической активности, и в частности, недостаточный уровень биосинтеза целлюлаз, гидролизующих фильтровальную бумагу.
Цель изобретения - получение нового высокопродуктивного штамма, обладающего более высоким уровнем биосинтеза целлюлаз.
Цель достигается путем создания нового штамма Trichoderma viride ВНИИгенетика 13/10, который представляет собой мутант, полученный в результате многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов из штамма ВНИИгенетика Б7.
Предлагаемый штамм 13/10 имеет существенные отличия от штамма-прототипа Б7 как по уровню активности, так и по ряду культурально-морфологических признаков. В отличие от прототипа штамм 13/10 при росте на комплексных агаризованных средах образует более мелкие колонии диаметром 15-25 мм с неровным лопастным или волнистым краем. Воздушный мицелий пушистый, плотный, спороношение слабое. Конидии округлой формы палево-желтого цвета, крупные (d_е = 7,26 0,39 , d_w = = 6,25 0,37 ) и мелкие (d_e = 4,52 0,096 , d_w = 3,91 0,1 ). Процентное соотношение крупных и мелких конидий выше, чем у штамма Б7 (7 суток роста - 30: 70, 26 суток роста - 55: 45). В отличие от прототипа штамм ВНИИгенетика 13/10 медленнее разжижает желатину (к 25-30 суткам роста) и пептонизирует молоко (к 14-18 суткам инкубации), Обладает способностью слабо восстанавливать нитраты (к 25-30 суткам роста).
Штамм ВНИИгенетика 13/10 отличается более высоким уровнем биосинтеза целлюлолитических ферментов
С₁ активность - 250-300 мг/мл глюкозы (0,9-1,2 МЕ/мл)
С_х активность - 200-250 мг/мл глюкозы (37,3-46,3 МЕ/мл)
Гидролиз фильтровальной бумаги - 17-18 мг/мл глюкозы (1,6-1,7 МЕ/мл).
Предлагается штамм Trichoderma viride ВНИИгенетика 13/10. Хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМПМ F 120.
Характеристика штамма Trichoderma viride ВНИИгенетика 13/10.
Культурально-морфологические признаки.
Синтетическая среда Чапека с сахарозой - на 4 сутки роста диаметр колонии 30-35 мм. Край колонии лопастной. Колония не имеет правильной формы. Поверхность колонии ровная Воздушный мицелий паутинообразный, бесцветный. Конидии бледно-палевого цвета, расположены в центре колонии. Конидиеобразование скудное. Среда не окрашена. Сусло-агар - на 4 сутки роста диаметр колонии 15-20 мм. Колония плоская, компактная, с неровным волнистым краем. Мицелий приподнимающийся, слегка пушистый, белый. Конидии бледно-желтого цвета, расположены по всей поверхности колонии и более обильно кольцом вокруг центра. Конидиеобразование слабое. Среда окрашена в ярко-желтый цвет.
Среда Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта - на 4 сутки роста диаметр колонии 20-25 мм. Колония выпуклая с приподнятым центром. Край колонии лопастной. Воздушный мицелий пушистый, плотный, белый, по краю колонии бесцветный, стелющийся. Конидии желто-палевого цвета, расположены по всей поверхности колонии, кроме ее края. Среда окрашена в желтый цвет.
Размеры конидий (среда Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта).
Конидии округлой формы, двух типов: крупные и мелкие. На 7 сутки роста культуры диаметры крупных конидий: d_е = = 7,26 0,39 , d_w = 6,25 0,37 , мелкие - d_е = 4,52 0,096 , d_w = 3,91 0,1 . Процентное соотношение крупных и мелких конидий 30-70 соответственно. На 26 сутки роста культуры диаметры крупных конидий: d_е = 6,64 0,03 , d_w = 5,9 0,02 , мелких - d_e = 4,92 0,106 , d_w = 4,67 0,227 . Процентное отношение крупных и мелких конидий с возрастом культуры увеличивается до 55: 45 соответственно.
Физиолого-биохимические признаки.
Желатину (20% ) разжижает полностью к 25-30 суткам роста.
Молоко пептинизирует к 14-18 суткам роста с пощелачиванием к 24-25 суткам до рН 7,8-8,0. Нитраты слабо восстанавливает к 25-30 суткам инкубации. Крахмал (2% ) гидролизует полностью к 10-12 суткам роста.
Глюкозу, галактозу, лактозу, фруктозу, целлобиозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, рамнозу, сахарозу, глицерин - ассимилирует.
В условиях глубинной ферментации синтезирует полный комплекс целлюлолитических ферментов.
Примеры использования штамма ВНИИгенетика 13/10 для получения целлюлолитических ферментов.
Для получения целлюлолитических ферментов исходный посевной материал получают путем выращивания штамма 13/10 на скошенном агаре (среда Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта или сусло-агар) в течение 4 суток при 28-30^оС с последующим выдерживанием культуры при девном освещении в течение 3 суток.
П р и м е р 1. Для осуществления процеса ферментации используют жидкую ферментационную среду следующего состава, % : Свекловичный жом 3,0 Зерно-картофельная барда 5,0 КН₂РО₄ 0,2 MgSO₄ 7H₂O 0,03 NaNO₃ 0,4 (NH₄)₂SO₄ 0,4
Для повышения активности к среде могут быть добавлены пшеничные отруби и солодовые ростки.
Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл при объеме среды 100 мл. Оптимальная температура инкубации 28-30^оС. Засев ферментационной среды осуществляют водной суспензией конидий из расчета 106 конидий на 100 мл среды.
Через 96 ч ферментации уровни активностей целлюлолитических ферментов при определении по методам Мандельс и Вебера составляют:
С₁ активность (гидролиз хлопкового волокна) - 250-300 мг/мл глюкозы или 0,9-1,2 МЕ/мл
С_х активность (гидролиз натрийкарбоксиметилцеллюлозы) - 220-250 мг/мл глюкозы или 37/46 МЕ/мл.
Гидролиз фильтровальной бумаги - 17-18 мг/мл глюкозы или 1,6-1,7 МЕ/мл
П р и м е р 2. Ферментацию осуществляют в ферментерах емкостью 15 м³ на среде, состав которой указан в примере 1.
Засев ферментационной среды: а) суспензией конидий, б) глубинным посевным материалом.
Глубинный посевной материал получают путем инкубации культуры штамма 13/10 на среде того же состава в колбах или инокуляторах в течение 12-30 ч при 28-30^оС.
Целлюлолитическая активность, определяемая по гидролизу фильтровальной бумаги, при продолжительности культи- вирования 108-120 ч и 28-30^оС составляет 15-17 мг/мл глюкозы или 1,3-1,6 МЕ/мл культуральной жидкости. (56) Авторское свидетельство СССР N 745933, кл. С 12 D 13/10, 1978.
Авторское свидетельство СССР N 591502, кл. С 12 D 13/10, 1975.