Штамм бактерий pseudomonas fluorescens для получения препарата против грибковых заболеваний растений

Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКМ СР 328Д для получения препарата против грибковых заболеваний растений.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и поэтому может быть использован для защиты от них сельскохозяйственных растений.
Известен штамм Pseudomonas sp. подавляющий рост фитопатогенного гриба Helminthosporium sativum, возбудителя корневой гнили злаковых растений (1). Однако сведения о спектре его действия отсутствуют.
Известен штамм Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum (2). Однако отсутствуют сведения и о его спектре действия на фитопатогены.
Известен штамм Pseudomonas cepacia, активный против широкого спектра фитопатогенных грибов (3). Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на таких широко распространенных и вредоносных возбудителей болезней растений, как Alternaria spp. Helminthosporium, Botrytis, Fusarium.
Целью изобретения является получение нового природного штамма с широким спектром действия на возбудителей грибковых заболеваний растений.
Новый штамм был выделен из опада залежи косимой в Каменной степи Воронежской области в 1981 г. Он характеризуется следующими признаками. Это палочковидные подвижные клетки с полярными жгутиками, размером 0,6-0,7, 1,2-1,5 мкм, грамотрицательные, спор не образуют.
Морфология колоний на питательных средах определялась после роста в течение 4-5 суток при 28^оС. Колонии на мясо-пептонном агаре (МПА) беловато-серые, слизистые, выпуклые к центру с волнистыми краями, диаметр 5-8 мм. Пигмент зеленый, диффундирующий в среду. Под ультрафиолетовым светом (260 нм) вокруг колоний наблюдается флуоресцирующая зеленая зона. На МПА с 2% глицерина колонии беловатые, густослизистые, выпуклые, крупные. Со временем (через 3-5 суток) желто-зеленый пигмент становится темнорозовым. На диагностических средах Кинга: Кинг А пигмент отсутствует. Кинг Б интенсивный зеленый флуоресцирующий пигмент и игольчатые кристаллы.
На МПА косяках штрих серый, блестящий, маслянистый, слабо выпуклый, пигмент зеленый, иногда розовый, друзы кристаллов.
Физиолого-биохимические свойства.
По отношению к кислороду облигатный аэроб, метаболизм дыхательный. В факторах роста не нуждается. Образует аргининдигидролазу и оксидазу. Протеолитические свойства выражены слабо: желатин разжижает на 5-7 день, полная пептонизация молока наблюдается только на 10-15-й день, образует на молоке желто-зеленый пигмент. Редуцирует нитраты до нитритов. Крахмал и целлюлозу не гидролизует.
Оптимальная температура роста 28-30^оС. Растет при 4^оС и не растет при 41^оС. Хорошо растет в пределах рН среды от 5,0 до 8,0. Устойчив к NaCl: растет при 3% и 5% NaCl в среде.
Усваивает как единственный источник углерода арабинозу, ксилозу, глюкозу, глицерин, маннит и не усваивает лактозу, мальтозу, дульцит, инсулин. Использует аммиачные и нитратные соли азота в качестве единственного источника азота.
Штамм устойчив к ампицилину (200 мкг/мл) и чувствителен к тетрациклину (10 мкг/мл), хлорамфениколу (20 мкг/мл), стрептомицину (100 мкг/мл).
Штамм не вирулентен для лабораторных животных: при введении внутрибрюшинно белым мышам 14-16 г по 0,5 мл 1 млрд. взвеси клеток 18-часовой культуры штамма в течение 30 дней не вызывали гибели животных.
Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма.
Штамм хранится на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее 1 года. Для лиофилизации клетки штамма выращивали на агаризованном бульоне Хоттингера и смывали средами, обычно применяемыми для лиофилизации.
Штамм идентифицирован:
1) по первоисточнику H.Stolp, D.Gadkari, Prokaryotes. Berlinea, 1981, v. 1, ch. 61, p. 719-741.
2) по определителю Kried N.R. et all. Bergey's mannual of Systematic Bacteriology. London, 1984, v. 1.
П р и м е р 1. Для получения нового препарата против фитопатогенных грибов новый штамм выращивали в течение суток при 30^оС на чашках или на матрицах с агаризованным бульоном Хоттингера. Клетки смывали фосфатным буфером (рН 72) и разводили до титра 10⁸-10⁹ клеток на 1 мл. С 1 см² поверхности питательной среды получали 1 х 10⁹ клеток.
Для выращивания бактерий можно также использовать картофельный агар, для смывания физиологический раствор или стерильную прокипяченную воду. При необходимости препарат лиофилизируют.
П р и м е р 2. Изучена антагонистическая активность нового штамма Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-328Д. Культуру бактерий высевалисплошным "газоном" на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или среда Кинга Б) и выращивали при 28^оС в течение 2-3 суток. Затем пробочным сверлом (диаметр 8-10 мм) вырезали диски агаризованной среды с культурой нового штамма и размещали их на поверхности другой агаровой пластинки (среда Чапека или картофельный агар), предварительно засеянной глубинным способом суспензией фитопатогенного гриба из расчета около 100 спор на 1 мл среды. Чашки помещали в термостат при 28-30^оС на 3-6 суток. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг диска с культурой нового штамма Pseudomonas fluorescens ВКМ СR-328Д. Срок инкубации чашек в термостате зависит от скорости роста тест-организма (фитопатогенного гриба).
Изучена антигонистическая активность нового штамма относительно 7 видов фитопатогенных грибов. Результаты приведены в табл. 1.
Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что новый штамм P. fluorescens ВКМ СR-328Д оказывает антагонистическое действие в отношении всех исследованных видов фитопатогенных грибов, о чем свидетельствует наличие зон отсутствия или подавления роста культуры тест-организмов вокруг дисков с клетками нового штамма.
П р и м е р 3. По методике примера 1 получен препарат нового штамма Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-328Д. Полученную суспензию не подвергали лиофилизации и использовали при выращивании маточных посадок гвоздики ремонтантной в совхозе "Оранжерейный комплекс" Московской области для получения элитного материала ускоренных черенков. Для предотвращения заболевания растений фузариозом препарат нового штамма вводили в субстрат для их выращивания в количестве 1 л суспензии на 1 м³ субстрата. В контроле растения выращивали без добавления препарата в субстрат. Результаты приведены в табл. 2.
Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что при выращивании гвоздики без применения препарата из нового штамма наблюдается ежемесячный выпад в среднем 12% растений. Поэтому к концу третьего месяца выращивания погибает 35-45% растений. При этом оставшиеся растения были на 70% заражены скрытой инфекцией, что делает полностью невозможным использование данных маточных растений для производства элитных посадочных материалов гвоздики.
При внесении препарата из нового штамма Рsendomonas fluorescens ВКМ СR-328Д в субстрат для выращивания маточных растений гвоздики с использованием суспензии клеток в концентрации 5х10⁸-5х10⁹ кл/мл ежемесячный выпад растений не превышал 2% При этом зараженность скрытой инфекцией оставшихся растений не превышала 0,5%
Использование: изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к производству препаратов против грибковых заболеваний растений, и касается нового штамма,предназначенного для получения вышеуказанных препаратов. Сущность изобретения: Штамм Pseudomonas fluorescens выделен из опада залежи косимой. Депонирован в ВКМ под N CR-328Д. Для получения препарата против грибковых заболеваний растений штамм выращивают на агаризованном бульоне Хотингера при 30°С в течение суток, затем клетки смывают буфером, разводят до титра клеток 10⁸-10⁹ в мл. Штамм проявляет антагонистические свойства против грибов вида Alternaria sp., Botrytis cinerea, Fusarium heterosporium, fusarium moniliforme, Helminthosporium sativum, Selerotinia selerotiorum, Vertieillium dahlide. 2 табл.