Способ прогнозирования врожденной патологии у детей

)5 6 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(21) 4799190/14 (22) 05,03,90 (4 б) 23.05.93. Бюл. М 19 (71) Республиканский научно-исследовательский центр охраны здоровья матери и ребенка Минздрава Республики Казахстан (72) В,Ю.Сосновская, Н,П,Михайличенко и В,С,Толмачев (73) Республиканский научно-исследовательский центр охраны здоровья матери и ребенка Минздрава Республики Казахстан (56) Неопатология под ред. Гаврюшина В.А., Сошниковой Н.А. - Л.: Медицина, 1985, с,334, (54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВРОЖДЕННОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ (57) Использование; в медицине и может применяться при диагностики в неопатолоИзобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике.Цель изобретения - прогнозирование врожденной патологии у детей путем фенотипической оценки микроаномалий развития и микрофлуориметрии ядер лимфоцитов препаратов крови.Поставленная цель достигается тем, что новорожденные обследуются клинически и при выявлении у них пяти и более фенотипических признаков микроаномалий развития проводится анализ крови, суть которого заключается в определении интенсивности свечения комплекса: дезоксирибонуклеиновая кислота - флуорохромный основной краситель акридиновый оранжевый (ДНКгии, в том числе и в медицинскои генетике. Сущность изобретения: проводят фенотипическую оценку количества микроаномалий развития у новорожденных с последующим микрофлуориметрическим исследованием структурно-функциональных особенностей хроматина лимфоцитов периферической крови, регистрируемых по изменению связывания флуорохромного красителя акридинового оранжевого с ДНК хроматина лимфоцитов. При выявлении у новорожденного 5-ти и более микроаномалий развития и изменений связывания с ДНК красителя более чем на 16% по сравнению с контролем ребенка выделяют в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, Способ позволяет повысить точность прогноза, 3 табл. АО). При изменении связывания флуорохрома с ДНК, регистрируемого микроцитсфлуо, риметрией ядер лимфоцитов, свыше 16 О по сравнению с контролем (клинически здоровые индивиды), выделяютребенка в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии,Способ осуществляется следующим образом: проводят оценку фенотипических проявлений микроаномалий развития у новорожденных. Перечень используемых микропризнаков включает микроаномалии развития шеи и туловища, кожи, волос, головы и лица, глаз, ротовой полости, ушей, позвоночника, конечностей, живота и половых органов. Цитохимический анализ крови проводят так; мазок готовят непосредственно из 20 - 15 мкл цельной крови, взятой из пальца. Мазки не подсушивая, фиксируют в смеси абсолютного этанола и ацетона (1:1) не менее 30 минут и ри комнатной температуре (при температуре+4 С возможно хранение препаратов в фиксирующей смеси до 72 ч). Затем проводят гидратацию препаратов, последовательно инкубируя их по 5 мин в спиртах понижающей концентрации (100, 90 О, 60 О, 30), промывают в дистиллированной воде 1 мин. После этого препараты инкубируют 5 минут в ацетатном буфере (рН 4,4) (5,5 г ацетата натрия - СНЗСООИа ЗН 2 О и 6,8 г хлорида натрия - йаС растворяют в дистиллированной воде, конечный объем раствора - 1 л, к нему необходимо добавить 4,9 мл ледяной уксусной кислоты - СНзСООН), Затем проводят окраску препаратов в течение 15 минут в растворе флуорохромного красителя акридинового оранжевого (АО), который готовят на ацетатном буфере - рН 4,4 (молярность раствора 10 ; 30,1 мг красителя-лрастворяют в ацетатном буфере, доводя объем раствора до 1 л), После окраски препараты 3 раза по 5 мин промывают в ацетатном буфере, содержащим акридиновый оранжевый в концентрации 10 М (2 мл раствора АО 10М и 198 мл раствора ацетатного буфера) и заключают в каплю того же раствора под покровное стекло, края которого окантовывают резиновым клеем, Интенсивность связывания красителя ядрами лимфоцитов регистрируют на зондовом цитофлуориметре типа Люмам-И 3, Люминесценцию возбуждают светом с длиной волны 436 нм при помощи интерференционного опак-иллюминатора, Интенсивность зеленой (530 нм) люминесценции выражается в условных единицах, снимаемых со светового индикатора числового вольтметра, Изменение флуоресценции комплекса ДНК-АО у обследуемых оцениваюг в процентах относительно показателей контроля (донора). Для сопоставления показателей нормы и патологии берут усредненные данные флуоресценции 10 клеток каждого образца, причем окраску сравниваемых препаратов производят одновременно, Изобретение иллюстрируется следующими примерами;П р и м е р 1. Ребенок Р-ко, родился 29,10.1985 г от первых родов (В ист. развития новорожденного - 4276), Беременность протекала без особенностей. Матери ребенка 22 года, отцу - 23, родители практически здоровы. Роды срочные. Родился живой доношенный ребенок мужского пола массой 3100 г, рост 50 см, с оценкой по шкале Апгар - 8-9 баллов, Период адаптации протекал благоприятно. На.З-и сутки была взята кровь на цитохимический показатель - изменение флуоресценции комплекса ДНК-АО в пределах нормы (2), Измикроаномалий развития у ребенка отмеча 5 лось высокое небо(количество микроаномалий развития (МАР) - 1). Объективносостояние ребенка расценивалось как удовлетворительное, На 7-е сутки ребенок выписан домой. Пои обследовании ребенка в10 катамнезе (возраст 1 г.) наблюдалось соответствующее возрасту физическое и психомоторное развитие. В момент осмотраребенок практически здоров,П р и м е р 2, Ребенок М-ва, родился15 26.12,1985 г., от вторых родов (В ист, развития новорожденного - 5215), Первая беременность в 1982 гот 1 брака закончиласьсрочными родами, ребенок здоров. Даннаябеременность - 2-я, от второго брака, Про 20 текала с явлениями угрозы прерывания присроке 7-8 недель, женщина находилась настационарном лечении, получала сохраняющую терапию. Мать страдает экстрагенитальным заболеванием - эобстепени,25 отец здоров. Роды пои сроке 39-40 недельпротекали беэ особенностей. Родилась живая доношенная девочка массой 3000 г, рост50 см, с оценкой по шкале Апгар - 7-8 баллов. Состояние ребенка расценено какудов 30 летворительное. Фенотипически у ребенка1при рождении отмечено 6 МАР: телеангиэктаэии из затылке, уздечка верхней губы,дизморфичные ушные раковины, клинодактилия мизинцев на руках, высокое небо,35 кожная синдактилия - пальцев на стопах, На 3-и сутки у ребенка была взятакровь на цитохимический анализ - отличиеинтенсивности свечения ядер лимфоцитовот контроля составляло 18 оь. С учетом вы 40 явленных МАР и цитохимического показателя крови ребенок был выделен в группуриска по реализации наследственной иврожденной патологии, В катамнезе, в возрасте 1 года, ребенок был повторно обсле 45 дован, установлено, что становлениеопорно-двигательнои и речевой функции уребенка идет с задержкой. Ребенок состоитна учете у невропатолога с диагнозом - перинатальная энцефалопатия неясного гене 50 за. Также была выявлена патология состороны мочевыделительной системы, ребенок состоит на учете у уролога с диагнозом- аномалии развития мочеточников, вторич ный пиелонефрит.55 П р и м е р 3. Ребенок Б-в, родился6,10.1985 г., от 3-й беременности, 2 срочныхродов. Матери ребенка 31 год, отцу - 31 год,Мать страдает хроническим заболеванием -неспецифический полиартрит, с обострением в 3-4 недели беременности. Отец - инва1817854лид 1 группы (после травмы). У женщины Медицина, 1978, с, 294). Для МАР значение первая беременность в 1977 г.закончилась границы проявления наследственной и срочнымиродамибезособенностей, разви- врожденной патологии равно 5 (выборка тие ребенка соответствует возрасту. Вторая здоровыхчелдетей с наследственной беременность - медицинский аборт без ос и врожденной патологией - 35; значимость ложнений. Данная беременность - третья, различий - 0,00001); для цитохимического прот зкала с явлениями токсикоза полови- теста - 16 (выборка здоровых составила ны беременности. Роды срочные без осо челдетей с отклонениями в состоянии бенностей, родилась живая доношенная здоровья 109, значимость различий - девочка массой 3350 г, рост 50 см с оценкой 10 0,00001).по шкале Апгар 7 - 8 баллов. Фенотипически Учитывая данные вышеприведенных ису ребенка отмечалось 10 МАР: монголаид- следований было проведено комплексное ный разрез глазных щелей, гипертелоризм, клиника-лабораторное обследование 79 ноэпикант, узкое небо, дизморфичные ушные ворожденных в раннем неонатальном пери- раковины, четырехпальцевые борозды на 15 оде и повторно в годовалом возрасте обеих ладонях, брахидактилия, брахицефа- (только клинический осмотр),пия, выраженная общая гипотония, аускуль- Результаты обследования приведены в тативно выслушивается систолический шум табл, 2,на верхушке. Ребнку был выставлен клини- Наследственная и врожденная патолоческий диагноз синдром Дауна. На вторые 20 гия диагностирована у 35 детей (группы 1 а, сутки жизни у ребенка было взята кровь на 1 б,4 а,4 б), причем при рождении патология цитохимический и цитогенетический анали- была выявлена у 20 детей, в возрасте года - зы, Цитохимический тест показал отличие у 15. А предлагаемый способ позволил вьют контроля на 22 . Цитогенетический ана- делить в группу риска в раннем неонатальлиз крови получен через месяц, который 25 ном периоде иэ них 34 ребенка (30 подтвердил клинический диагноз: кариотип новорожденных проходили в группу риска 47 хх + 21. по обоим критериям - группа 1 а, 4-ро поПри обследовании новорожденных де- одному из тестов - группы 1 б, 4 а).тей нами было обнаружено сочетание до- Из 34 новорожденных, имевших надпостоверного увеличения количества МАР и 30 роговые значения цитохимических показадостоверного(р 0,001) изменения связыва- . телей (группы с 1 а по 6 а), 5 и более МАР ния флуорохрома АО с ДНК хроматина лим- обнаружено у 91,2 (31 ребенок - группы фоцитов у детей с врожденными и 1 а,2 б), Иэ них врожденная и наследствен- наследственными заболеваниями раэлич- ная патология диагностирована у 30 детей ного генеэа по сравнению со здоровыми 35 (группа 1 а)Структура потоков представлена: врожденные пороки сердца, ортопедиПроведена клиническая оценка состоя- ческая патология, патология органов слуха, ния здоровья детей в катамнеэе (203 чел.). зрения, почек и мочевыделительной систеУстановлено, что физическое развитие де- мы, Лишь 1 ребенок (группа 4 а) с врождентей взаимосвязано с количеством микро ной патологией имел меньше 5 МАР, но аномалий развития: так, только 26,8 Я, детей цитологический тест у него превышал порос повышенной стигматизацией имели пока- говое значение.затели физического развития, соответству- Детей, изменения структуры хроматина ющие .их возрастной норме. Аналогичная которых не превышали 16 Я, (по сравнению связь установлена при оценке психомотор с контрольными показателями), наблюданого развития детей; у 67,9 Я, детей имею- лось 45 человек(группы с 1 б по 6 б). Из них щих пять и более МАР, отмечалась задержка более 5 МАР было у 7 (15,6) (группы 1 б, психомоторного развития, тогда как у де б, Зб), Причем, у 3-х из них была выявлетей, имеюших 1 МАР-лишь в 2,3 случаев, на врожденная патология (группа 1 б), 2-еПо оценке максимального расхождения 50 состояли на диспансерном учете у неврофункций распределения двух выборок (эдо- патолога по поводу перинатальной энцефаровые и новорожденные с отклонениями в лопатии (группа 2 б) и лишь 2 ребенка были состоянии здоровья) определены статисти- практически здоровы (группа Зб),ческие высокоэначимые значения границчувствительности предполагаемых диагно (группы 4 б, 5 б, 6 б) и только у 1 иэ них диагстических критериев: количество МАР и ци- ностиродали врожденную пагологию (врожтохимический показатель (Критерий денная глухота, возможно, тератогенного Колмогорова-Смирнова-Гублер Е.В. Вычис- характера) (группа 4 б).лительные методы анализа и распознава- По данным кад нным катамнеза выяснено, что ния патологических процессов. - М.: практически здоровых,".,етей было 35 чело1817854 Таблица 1 Данные клинико-лабораторного обследования новорожденных Группы обсле дняя частота микроаномалий развития Изменение и флуоресценц ДНК-АО(внных но рожденны ате(и = 240)7,96 +0,4 (и 167) оровые Сер 3,ной и наследственной патологией Дастверность различий (рвек (группы Зб, ба, 6 б): у 32 оба критерия (количество МАР и цитохимический показатель) имели значения соответствующие норме (группа 6 б), у 2-х детей количество МАР превышало 5 (группа Зб), у 1-го пороговое значение превышал цитохимический показатель (группа 6 а),Чувствительность способа соответствует 70,5, т.к. ложно-отрицательный результат(хотя бы по одному из критериев) из 44 действительно больных детей (группы 1 а, 1 б, 2 б, 2 б, 4 а, 4 б, 5 а, 5 б) наблюдался у 13 (группы 16, 2 б, 4 б, 5 б, 4 а, 5 а); а учет ложно- отрицательного результата одновременно по двум критериям дает чувствительность предлагаемого способа 86,4, Специфичность - 91,4: ложнополажительные результаты иэ 35 здоровых детей (группы Зб, ба, 6 б) отмечены у 3-х (группы Зб, 6 а) (по одному из двух учитываемых критериев; ложноположительных результатов по 2-м критерием одновременно среди здоровых не отмечено).Данные клинико-лабораторного обследования детей представлены в табл. 3.На основании представленных материалов можно заключить, что предлагаемый способ позволяет в ранние сроки выявлять среди здоровых новорожденных детей группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, что представляется важным для своевременного назначения коррегирующей терапии. Кроме того. отметим дополнительные преимущества предлагаемого способа: позволяет дать объективную оценку состояния новорожденного, выраженную в числовых значениях; относи тельная дешевизна способа (стоимость одного анализа составляет 2 рубля 80 коп.); позволяет значительно ускорить диагностическую процедуру (анализ проводится за 2- 2,5 ч, тогда как на кариотипирование 10 затрачивается в среднем 101 ч на способвыбранный за прототип - 7 часов; 4- мало травматичен (для анализа достаточно капли крови), прост в исполнении и не требует высококвалифицированной подготовки ис нолнителя, импортных препаратов и аппаратуры,Формула изобретения Способ прогнозирования врожденной 20 патологии у детей путем фенотипическойоценки микроаномалий развития, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, у новорожденного при выявлении пяти и более фенотипических 25 признаков микроаномалий развития допол нительно проводят микрофлуориметриюядер лимфоцитов препаратов крови, предварительно окрашенных акридиновым оранжевым, измеряют интенсивность флуо ресценции акридинового оранжевого и приее увеличении относительно нормы на 16 и более прогнозируют врожденную патологию.1817854 10 Таблица 2 Распределение детей с учетом пороговых значений количества микроаномалий развития и цитохимического теста по группам в соответствии с состоянием здоровья (по данным ката мнеза)Цитохимический тест Количество Группы детей микроаномалий развития показатели показатели(1 6) 30 5 32 Таблица 3 1Регистр, Г УФамилияматери Наличие врожденной или наслепствен, патологии ребенка при рожде- в катамнезении кол-во изменение флуо- ИРР ресценции РОРНК (в Ъ) 1 И-а 61 0 2 Б-а 3 А-а 103 Х-ч 10/200 5 т-р 17/214 б О-и 1437 Ка 71 8 М-а 85 9 Я-о 10 Ро 3 Превышаетпороговоезначение(5) Ниже порогового значения (5)С наследственной и врожденной патологией Диспансерного наблюдения ЗдоровыеС наследственной и врожденной патологией Диспансерного наблюдения ЗдоровыеПоказатели клиниколабораторного обследования новорожденного равны илипревышаютпороговое значение ниже порогового значения (16)1817854 1 23 11. П-а 14/20812 И-а Э/198 713 13150 19 П-г 137 20 С-а 139 21 К-а 161 22 Х-а 4/188 24 И-а 21/224 25 К-а 23/226 26 Б-а 24/220 27 Т-а 13328 Т-а 46 . 29 К-а 87 1 О 30 С а 11531 Щ-а 120 32 А-а 14533 С-а34 И-а 8 35 С-а 18 36 Б-а 40 37 С-а 59 22 38 Л-а 7339 Х-а 109 13 П-а 14 Д-х 15 Б-а 16 К-о 17 К-о 18 М-а 11/202 12/204 20/222 22/220 38 13 01618 Прололжение табл, 3 Ретский церебральный паралич Перинатальная энцефалопатия Перинатальная энцефалопатия Перинатальнаяэнцеалопатия,пиелонеФр,Перинатальная энцебалопатия Лисплаэия тазобедренных суставов Перинатальная энцеФалопатия187854 14Пролопжение табл, 3 т40 Н-а 41 Б-а 112 Дисплазиятазобедренных суставов 12 28 Врожденныйпороксердца Врожденный порок сердца, задержка, психо-физического развития 18 49 М-а Перинатальная энцефалопатия,гипотрофия,50 К-а 26 30 17 15 51 Л-я 52 Н-а 20 56 И-я Врожденныйвывихбедра 42 С-а 27 43 1-а 28 44 Г-а 48 45 Л-я 20746 Г-а 67 47 Р-а 117 48 К-а 237 53 В-о 191 54 И-а 19 55 К-а 91 геег г е е,0 исплазия тазобедренныхсуставов Пеоинатапьная энцефалопатия исплазия тдзобедренных суставов Врожденная катаракта Врожденный пороксердца, перинатальная энцефалопатия Лномалия, развития мочеточника,вторичный пиелонефрит, перинатальная энцефало"патия Перинатальная знцефалопатия Патология зрения Патология опорнодвигательного аппарата МВПР неклассифицированный комплекс Лисплазия тазобедренных сус тавов Врожденный порок сердца, перинатальная энцефалопатия Врожденный Вывих бедра1817854 16 табл, 3 26 ВПР 8 8 30 30 говая грыжа 18 165 67 А-а Миопатия 68 ц-а 176 МВПР БолезньДауна 10 1 О БолезньДауна 41 БолезньДауна 30 МВПР 12357 Ф-а 95 58 М-а 107 59 Ч-а 172 60 К-а61 П 62 С-а 138 63 В-р 5 64 К-а 64 65 Ш-о 94 66 Н-я 98 69 Б-а 97 70 Н-а 6 71 Р-о 96 72 М-а 100 73 Т-а 132 74 К-а 159 Продолжение б Спиномозговая грыжа АномаладТ.-ТТ. жаберных дуг СпиномоэСпиномозговаягрыжа Косоглазие,миопия Фиброзная дисплазия Экзостаэы Синдром ИерещевскогоТернера Аномалад Т жаберных дуг МОПР (патологиязрения, почек,врожденный пороксердца) Синдром ВидегланаБеквита Спинолозговаягрыжа ВПР (патологияопорно-двигательного аппарата,задержка психоречевого развития) ВПР ЦНС, миопатияДющена Синдром Шепещевского-Тернера Болезнь Дауна ВПР, патология обменного характера, миопатия Болезнь Дауна Болезнь Дауна Синдром КоФйина-Сириса Синдром Лоуренса-Муна-Бидля1817854 Продолжение табл,3 76 Ч-а 36 8 Синдром Нуннена МВПР 12 МВПР 127 77 Р-ь Болезнь Дауна 12 78 8-а 93 50 79 А-а Составитель В, СосновскаяТехред М. Моргентал Корректор М. Куль Редактор Т. Иванова Заказ 1741 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 36 41 БолезньДауна Микроцефалия Перинатальная энцеФалопатия Рото-пальцелицевой синдром СиндромКоккейна