Способ получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада

1О П И С А Н И Е, 99 д 99ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскиа Социалистическиа Республик(51)М. Кл.з А 61 К 39/116 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийДата опубликования описания 150283 Иностранецбинко Стойкович (СФРЮ) 72) Автор изобрет Иностранная фирмЗолько Базель АГ" (Швейцария)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ТРИХОМОНАДАаО, 3 -ными 0,5-ным овышенияны, последобавляютнатрий-этил,из влагалиндромом триы 17.10,77тоянии вве 1 - сц 1 сцобозначени5 472.77 ( в лиофи-. п йгеа 1еь (Баори м отосемьтся грам- цепей Ни СВ от являю форму морфологии и колоний, отмалы и имеют лонии больше в Изобретение относится к медицине,и касается способа получения гетеровакцины для лечения синд- рома трихомонада. %Известен способ получения гетеро вакцины, заключающийся в том, что на питательных средах отдельно выращивают культуры микроорганизмов ( коклюшные, дифтерийные, столбнячные), затем смешивают в определенных пропорциях убитые коклюшные микроорга-, низмы и анатоксины 111.Цель изобретения - получение гетеровакцины для лечения синдрома трихомонадаУказанная цель достигается тем, что согласно способу получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада ассоЬассегцв ас 1 дорЬ 1" 1 ца штаммы СВ 5 465.77, СВ 5 466.77 СВ 5 467.77, СВ 5 468,77, СВ 5 469.77, СВ 5 470.77, СВ 5 471.77 и/или СВ 5 472.77 порознь выращивают в жидкой питательной среде в аэробных 2 условиях, отделяют полученную биомассу, инактивируют ее и смешивают 3-8 штаммов микроорганизмов в равных количествах в физиологическом расторе или в объемах, обратно пропориональных .концентрациям микрооргизмов.При этом выращивание осуществлт при рН 6,1-6,8 и 32-45 оС. Инактивацию проводятраствором формальдегидараствором фенола.Кроме того, с цельюустойчивости гетеровакцсмешения микроорганизмоформальдегид, фенол илиртутьтиосалицилат.Штаммы взяты в 1976ща женщин, страдающих схомонада,Штаммы внесенлизированном сосЬцгеац чоог 5 сЬ 1 едерланды ) под5 465.77 до СВдельных штаммов).Все восемь штаммовположительными, имеютили палисада.Штаммы различны повеличине образующихсядельные колонии оченьф му круга, другие ко997599 имеют форму розетки с бороздками наповерхности. Таблица 1 Источник углевода.4657 Арабинд+ коза оз Салицин укро Трегпо+ Ксил Рибо ахмал77, 467. 77динаковымиативными своны таким обри всех восьмину, эффектнта, с помощпроис хожделечивают от ет из ни Оприды, наивания штамм ательные ср для культивименяют жидкие и Штаюи СВ 5 46 489.77 обладают ческими и фермен Штаммы подобр что при применени мов получают вакц для каждого пацие рых независимо о фекции успешно вы трихомонада.ииохими- йствами, 5 азом, и штамвную ью котоия ин синдрома Биохимические свойства штаммовпредставлены в табл. 1. более целесообразнаследующий составТриптоэо-пептон, гГидролизат,казеина, г,Мяснойэкстракт, гДиалиэатдрожже,вой, мл, Лактоза, г 10Дистиллированнаявода, млДо 1000Солевая смесь состоит из, г:Мд 50 7 КО11,5М,П 504 2 Н 10Ге 504 7 НтО 0,68Дистиллированнаявода, мл До 100рН жидкой питательной среды до водят до 6,1-6,8, предпочтительно 6,5, среду.стерилиэуют в актоклаве при 115 С 20 мин, затем разливают по колбам Эленмейера, куда вносят образцы каждого штамма, 20Культивирование проводят при 32-450 С, .предпочтительно при 37 С 48 ч, По истечении этого времени материал собирают в стерильных условиях и центрифугируют 1.ч при 3000 д.Осадок, образовавшийся из биологического материала, переводят в суспензию, предпочтительно в Физиологическом растворе, и затем инаытивируют обработкой формальдегида и фенолом, предпочтительна концентрация суспензии 0,3 в расчете на формальдегид и 0,5 в расчете на фенол при длительности обработки 3-5 дн.35После инактивирования суспензию снова центрифугируют 1 ч при 3000 д, чтобы освободить инактивированный материал от избытка формальдегида и фенола. 10 Материал, полученный от каждогоотдельногб штамма, снова переводятв суспензию, предпочтительно вфизиологическом растворе и проводят 45испытание на стерильность и на наличйе жизнеспособных лактобактерий.При отрицательных результатах этихиспытаний определяют плотность культуры для. каждого штамма или числомикроорганизмов на 1 мл культуральной жидкости,При .невозможности смешивания отдельных суспенэий непосредственнопосле инактивации их хранят при 4 С,либо каждый штамм лиофилизируют и в 55этом состоянии хранят при 4 С неменее 3-х лет. В качестве защитногоколлоидадля лиофилиэации пригодна. среда, состоящая из,желатин 5,5;сахароза 37,5 и лактобионат кальция 60О, 5. Лиофилизацию проводят 24 ч.Инактивированный материал иэ от.дельных штаммов смешивают в равныхколичествах. Полученную вакцину разбавляют физиологическим раствором так, что она содержит в 1 мл 14109микроорганизмов.Общее содержание азота в вакцинесоставляет 3,68 сухого вещества.Для повышения устойчивости к вакцинедобавляют консервирующее средство,например формальдегид или фенол,в концентрации 0,25 или этил-ртутьтиосалицилат натрия и оставляютвакцину при 4 фС 30 дн, прежде чемзаполнить ею ампулы емкостью 0,5 мл.Заполнение апирогенных ампул производят в стерильных условиях, ампулы лиофилиэируют и хранят при 4 фС.При 2-8 С вакцина сохраняется тригода, при 20 С - 6 мес,Вакцину испытывают на стерильность,токсичность, антигенное действие иналичие жизнеспособных лактобактерий.Для испытания на стерильность по1 мл вакцины помещают в пробирки стиогликолевой питательной средой ис бульоном Сабуро,пробирки инкубируют 10 дн при 37 С и соответствующий ряд обработанных пробирок инку-,бируют в течение того же временипри 25 С. Все пробирки в обух рядах,оказались стерильными.Испытание на токсичность производят на морских свинках и белыхмышах. Пяти морским свинкам со средним живым весом 300 г внутримышечно вводят по 5 мл вакцины (по 2,5 мл в каждуюзаднюю конечность). После наблюдейияв.течение 14 дн все животнь 1 е осталисьздоровы, в обработанных конечностях необнаружено никаких реакций,Вакцину вдозе 0,5 мл вводят также в заднююконечность десяти белым мышам сосредним живым весом 20 г. После Наблюдения в течение 14 дн все оказа-.лись здоровыми,Испытание на антигенное действиепроводят сначала на трех морскихсвинках, которым через 14 дн вводятвнутрисердечно по 5 мл вакцины,при этом никакой анафилактическойреакции не наблюдается. ЗатЕм вакцину испытывают и чсго в реакции иммунодиффузии по Оухтерлони с нормальной человеческой сывороткой, приэтом положительная реакция отсутствует. Для испытания на наличие жизнеспособных лактобактерий пробы вакцины культивируют на плотной питательной среде следующего состава:Вода, мл 800 Трипкаэеин, г 16Раствор 1, мл 50Раствор 2, мл 10 Раствор 3, мл 10 Раствор 4 мл 10Свежие дрожжи, г 10 Пептонсеребряный, г 10997599 Таблица 2 Через3 мес. Перед вак- цинацией Титр б мес 12 мес 2 нед после началавакцинации после 3-ей инъекции 16 1:10 1:10 120. Крахмал растворимый 0,5-.ный, г 5Вода, мл До 1000Раствор 1 состоит иэ 10-ного раствора МаС 1 раствор 2 состоит иэ 2-ного раствора КС 1 и 5-ного раствора МаС 0 , раствор 3 состоит иэ 2-ного раствора СаСХ, и 1-ного раствора МдС 1 и раствор 4 состоит из 2,5-ного, раствора КНРО 4 .К полученным растворам добавляют. 10 25 г агар-агара, доводят рН до значения 5,5-6,7, предпочтительно б, и стерилизуют 20 мин в автоклаве при.115 фС. Затем добавляют 100 мл водного раствора, содержащего 3 г мальтозы, 15 10 г глюкозы и 10 г лактозы, после чего добавляют 30 мл 1-ного раствора цистеингидрохлорида, причем каждый из этих растворов предварительно стерилизуют через стеклянный 20 фильтр 66В последнюю очередь в среду вносят 10 дефибринированной человеческой крови. Питательную среду засевают пробами вакцины и посевы инкубируют при 37 С. В качестве контроляосреду засевают ассоЬасег 1 цв ас 1- дорЬ 11 ца,и культивирование осуществляют при тех же условиях.В вакцине не обнаружено ни одного жизнеспособного микроорганизма, т.е, она является убитой, при этом она оказывает действие против инфекций, вызываемых микроорганизмами вида Тг 1 сЬоаопаь чад 1 па 11 в, т.е.от; носится к классу гетеровакцин.Вакцина вызывает образование спе-. цифических антител против 1.ассоЬасйег 1 ца ас 1 дорЬ 11 цв, в частности против полиморфных форм, ответственных Ъа патологические измененияве личины рН влагалища при трихомонадном синдроме.Иммунизирующее действие вакцины доказано на следующих опытах с животными и клинических испытаниях. 45Двум кроликам с живым весом 2950 г и 3200 г делают внутривенное вливание с интервалом в 2 нед. ЧерезЪ месяц после второго вливания берут кровь и выделяют сыворотку.В случае образоВания антител дают сыворотке агглютинироваться в разведении 1:50 лактобактериями тех штаммов, иэ которых готовится вакцина, при этом сыворотка в исследуемом разведении имеет положительный титр агглютинина. У обоих кроликов титр агглютинина перед вливанием был отрицательный при разведении 1;10, через. месяц после второго вливания титр стал положительным при разведении 1:160 или 1:180.Вакцина позволяет проводить лечебную и профилактическую обработку синдрома трихомонада ( острого хронического и асимптоматического).Для лечебных и профилактических делей рекомендуется дозировка 0,5 мл (7 10 микроорганизмов) внутримышечно, три раза с интервалом в две недели с последующим введением той же дозы инъекцйей Раннеля через год после начала лечения.Клинические исследования проводят на 97 пациентках, которые подверга" ются серологическим исследованиям,У пациенток согласно временному графику отбирают кровь и полученную сыворотку крови испытывают на присутствие лактобактериальных антител. Для этого сыворотку в возрастающем разведении (от 1:10 до 1:1280) обрабатывают вакциной из соответствующих антигенов или агглютининов и наблюдают происходящую агглютинацию.В качестве агглютининов используют свежеприготовленную суспензию инактивированных микроорганизмов 1.асйоЬасг.ег 1 цв ас 10 орЬ 1 цв тех же штаммов в том же весовом соотношении ид той же концентрации (14109 микроорганизмов на 1 мл), что и сама вакцина.Появление в сыворотке агглютинина и нарастание его титров показано в ,табл, 2.еред вакинацией Тит 4 О 1:80 2 6 в 320 3 8 640 2 о 97 бщи 9 1:293 5 1:35:120 Учитывая повышение титра агглюти забором крови, пациенток можно раснина в период между первым и вторым пределить, как указано в табл. 3. Т и 64 Х и б Х тра 2 Х 4 Х,Х выше ни ло пациенток Доля пациенок от обего, Ъ 0,3 3,4 Геометр еское реднее начени итра П р и м е р. 200 женщин в возрасте 15-59 лет, страдающих синдромом трихомонада, амбулаторно лечились вакциной, изготовленной из 8 штаммов. а Контроль осуществлялся на протяжении. 2-хлет. 138 пациенток 69 от общего количества ) прежде безуспешно лечились метронидаэолом. Перед начачом лечения наряду.с исследованием. 6 крови и мочи .проводилось гинекологическое исследование, включая колпоскопию и исследование по Рар"5 веаг, параллельно были взяты. мазка из влагалища, вульвы, шейки матки и уретры для приготовления нативных препара" тов и препаратов, окрашенных по .Граму и Гимзу. Культура была нанесе- на на Тг 1 сЬощопав чад 1 па 11 а. Иссле997599 дования были повторно проведены через 6 нед 4 и 12 мес . после началалечения.Перед началом лечения у 145 пациенток (,72,5) была установлена выраженная симптоматика синдрома три1хомонада с сильным кольпитом, зудом,обильными зелено-желтоватыми дурнопахнущими бейями, диспареунией и .дизигией, при колпоскопии выявленыотек и эритема эпителия и влагалищной части шейки матки и влагалища,Кроме того, у 61 пациентки была ус-,тановлена эритроплакия влагалищной.части шейки матки, у 13 - хронический цервицит. У остальных 55 пациенток (,27,5) обнаружен только легкийкольпит,Таблица 4 класс Перед нач вакцинаци 194Через 12 меспосле начала вакцинации 32 96,2) ( 4,5% 157женщины способны к образованию 55 тител, 198 (95,5) пациенток, пвергшихся лечению, через 12 месбыли вылечены от трихомоноэа(до лечения у них выделялись вагинальныебели по классу 11 и 111).60 Тот же результат был получен у55 пациенток с легкими кольпитами бедополнительной терапии. Пациенткичерез два года снова подвергалисьнаблюдению, за это время не выяви лось ни одного случая реинфекции. ан- одЛечение проводилось согласно приведенной дозировке. В случаях легТ ВРемЯ иссле- Число дования Девять па втором контр после вакцин еще определя паь, остал далее к лече ние трихомон изменило. Через 12 нения шейки кого цервици роплакии, чтциенток, у которых приоле (через три месяцаации) микроскопическилась ТгсПощопаь бацись невосприимчивыминию, пероральное введеацида также ничего не мес также остались иэмематки в форме хроничеста или значительной зрит о объясняется тем,что эти кого кольпита дополнительная терапияне применялась, йри острых симптомах;назначали антибиотики, а при тяжелыхсостояниях - дополнительно локальноеприменение препарата иэ штаммов(,ассоЬас сегце всдорЫцв, эффектив.ного против Моп 1 аз(з. Метронидазолили подобные ему нитроимидазольныепроизводные не назначали ни в одномслучае, Если выделения из влагалища. классифицировать по гочес, тоуспешность лечения можно проследитьпо табл. 4, где класс 1 означаетотсутствиезаболевания, класс 11негнойные бактериальные бели, класс111 - гнойные бактериальные бели,класс 1 Ч - гонорея (исследованию такие случаи не подвергались), классч - трихомонад (положительный нативный препарат), класс У 1 - микозвлагалища (Сапдса а 1 Ы са пя),997599 14 13 Формула изобретения Составитель Г. СмирноваТехред А.Лч, Корректор И. Шулла Редактор Н. Швыдкая Тираж 711 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений н открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 963/78 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Во время лечения и после него не было установлено никаких аллергиФ ческих и токсических реакций,однако следует воздержаться от вакцинации в случаеострых лихорадочных инфекций, болезней системз гемато поээа или тяжелойпочечной недостаточности. 101, Способ получения. гетеровакцины для.лечения синдрома трихомонада,э аключающийся втомчто 1.асйоЬасйег 1 цв асдорЬ 1 ца штаммы СВ.465.77, СВ 466.77, СВ 467.77,СВ 468.77, СВ 469.77, СВ 470,77,СВ 471.77 и/или СВ 472.77 порознь; выращивают в жидкой питательной среде в.;аэробных условиях, отделяют Э 3полученную биомассу, инактивируютее и смешивают 3-8 штаммов микроор-. ганиэмов в равных количествах в,физиологическом растворе или в.объемах, обратно пропорциональных концентрациям микроорганизмов.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с к тем, что выращивание осуществляют при рН 6,1-6,8 и 32- 45 фС.3. Способ по п. 1, о т л и ч а= ю щ и й с я тем, что инактивацию проводят 0,3-ным раствором Формаль дегида и О,5-ным раствором Фенола.4, Способ по и. 1, о. т л и ч а- ю щ и й с я тем, что, с целью повы 1 шения устойчивости гетеровакцины, после смешивания микроорганизмов добавляют формальдегид, Фенол илн "натрий-этилртутьтиосалицйлат. Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе1. МРТУВ 263-68 на АКДС вакцину.