Способ подготовки материала слизистой оболочки толстой кишки для гистологического исследования ее сосудистого русла

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 6 01 й 33/48, 1/28 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) Эксперименталдицина АН Арт, СС овательскии институтава Арменииян, А. М, Агавелян и ная и клиническая ме- Р. - 1965,т,5, М 1,сО(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ МАТЕРИАЛА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЛСТОЙ КИШКИ ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЕЕ СОСУДИСТОГО РУСЛА (57) Использование; в области медицины, в частности в клинической биохимии, Сущность изобретения: исследуемый материал фиксируют, готовят срезы и помещают их в Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для выявления пространственной организации терминального звена сосудистого русла в тканях и органах, в частности толстой кишки, в норме и при различных патологических состояниях с количественной характеристикой отдельных звеньев микроциркуляторного русла (МКР), а также для выявления и количественной оценки активности фермента аденозин-монофосфатазы (АМФ - азы),Цель изобретения - повышение точности и адекватности воспроизводимой картины путем выявления всех звеньев МКР слизистой оболочки толстой кишки вплоть до мельчайших капилляров и капиллярных сетей на микроскопическом уровне, характеристики их количественно-пространственной организации с определением некоторых объективных параметров, в том,.Я 2 1807397 А 1 инкубационную среду, промывают, обрабатывают реактивами с последующей его промывкой и окрашиванием, причем фиксацию проводят в смеси формалина и ацетона, взятых в соотношении 1:1, а инкубацию осуществл я ют в среде, содержащей 0,2 0-н ы й раствор аденозин-монофосфата, 20/,-ный раствор мединала и 20/О-ный раствор хлористого кальция, взятых в соотношении 7;2;1, при температуре 37 С в течение 40 мин, затем срезы промывают в трижды сменяемом 10-ном растворе хлористого кальция, помещают в 2%-ный раствор хлористого кобальта и после промывки дистиллированной водой окрашивают в 50 мл 5%-ного раствора сульфида аммония, просветляют и заключают в желатину, Способ позволяет повысить точность исследования, прост в исполнении, 6 ил,числе определение длины и диаметра сосудов, плотности капилляров и капиллярных сетей, а также вычисление радиуса диффузии.Достигается зто тем, что способ осуществляют в следующей последовательности: фиксируют материал в фиксирующей среде в течение 5 - 10 минготовят срезы толщиной 5 - 10 мкм, помещают их в инкубационную среду в термостат при 37 гр. в течение 40 мин, промывают в трех порциях 1% р-ра хлористого кальция, переносят в 2% р-р хлористого кобальта, обрабатывают разведенным р-ром желтого сульфида аммония, промывают, просветляют и заключают в желатину, причем в качестве фиксирующей среды используют смесь формалина и ацетона в равных соотношениях, а в качестве инкубационной среды - смесь 2% р-ра мединала и 20 р-рэ хлористого кальция и аденозин-монофосфата.С выявлением пространственной организации терминального звена сосудистого русла в слизистой оболочке толстой кишки описанный способ позволяет установить активность фермента АМФ-азы в перенхиматозных и строительных клетках. Как известно, указанный фермент принимают самое активное участие в энергетических, метаболических процессах и может служить дополнительным косвенным показателем состояния кровоснабжения, а количественная оценка активности АМФ-азы определяется по объемной фракции колоноцитов, содержащих этот субстрат,Сопоставительный анализ с прототипом дает основание сделать вывод, что заявляемый способ выявления сосудистого русла слизистой оболочки толстой кишки отличается от известного введением совершенно новых компонентов, а именно: смеси формалина и ацетона, аденозинмонофосфата, мединала, хлористого кальция.Анализ известных способов, используемых в гистологической практике для выявления сосудистого русла показал, что введенные в заявляемый способ вещества не применялись для выявления количественно-пространственной организации МКР слизистой оболочки толстой кишки и их применение обеспечивает быстрое, эффективное, комплексное и полноценное воспроизводство сосудистого русла, а именно: выявление звеньев МКР на всем его пространственном расположении, включая тончайшие капиллярные сети и синусоиды, изучение активности фермента АМФ-азы на тонких срезах и значительное сокращение временного фактора и упрощение состава инкубационных и буферных растворов,Сущность предлагаемого способа сводится к следующему:1, Фиксируют материал в смеси 12 формалина и ацетона в равных соотношениях в течение 5 - 10 мин,2. Срезы толщиной 5 - 10 мкм помещают в инкубационную среду, имеющей состав: 2 р-р мединала, 2 р-р хлористого кальция, субстрат аденозинмонофосфата с рН 9,2. Инкубируются срезы в термостате при 37 гр. в течение 40 мин;3, Промывают в трех порциях 1 р-ра хлористого кальция,4. Переносят в 2 р-р хлористого кобальта5, Промывают в трех порциях дистиллированной воды6. Обрабатывают разведенным р-ром желтого сульфида аммония.7, Промывают, просветляют и заключают в желатину,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для апробации заявляемого способа проведено изучение сосудистого русла слизистой оболочки толстой кишки. С этой целью были взятЫ кусочки слизистой оболочки толстой кишки, резецированной по поводу опухолей данной локализации, Причем нужно указать, что выборочно брались те случаи, где была удалена целиком одна половина толстой кишки(либо правосторонняя гемиколэктомия, либо левосторонняя). Это давало возможность исследовать относительно нормальную слизистую, находящуюся на большом расстоянии от края опухоли. Кроме того, проводили контрольное изучение слизистой этой зоны на выявление патологических изменений (аденомы, воспалительные процессы и др,) и только при отсутствии тех или иных структурных отклонений со стороны эпителия и стромы проводилось дальнейшее изучение МКР. Для этого часть материала обрабатывалась по общепринятой в гистологической практике методике и парафиновые срезы толщиной 5 - 6 мкм окрашивались гематоксилином и эозином. Другая часть обрабатывалась заявляемымм способом.При фиксации, обработке и окраске по указанному методу обнаружено, что основной мощный коллектор сосудистого русла располагается в подслизистой соединитель- но-тканной основе, Коллектор представляет собой крупнопетлистую сеть с полигональными ячейками с приводящим и отводящим (артериолярным и венулярным) отделами. Причем нужно отметить, что коллектор может иметь различную густоту, Иногда он представлен рыхлой сетью (фиг. 1), а в некоторых случаях он состоит из параллельно идущих артериолы и венулы (фиг. 2), Артериолы имеют обычно извитой ход, местами дают расширения, чередующиеся с сужениями просвета, Артериола, отходящая либо из коллектора, либо стволовая, проходит пооснованию желез, где дает многочисленные ветви, проходящие по боковой поверхности желез (фиг. 3). В отдельных участках боковая ветвь одной железы разветвляется, образуя капиллярную сеть и анастомозируя с осветлениями венулы, огибающей соседнюю железу. Иногда прекапилляр одной железы сообщается с посткапилляром соседней через тонкий поперечно-идущий анастомоз,В межжелезистой соединительной ткани встречаются зоны, где довольно густо расположены разветвляющиеся и переплетающиеся между собой пре-и посткапилляры, имеющие большую протяженность и дающие изгибы под прямым углом. Здесь образуется рыхлая крупнопетлистая капиллярная сеть (фиг, 4). В некоторыхслучаяхвыявляются анастомозы между длинной огибающей венулой и извитой ветвящейся артериолой у основания желез по типу шунта (фиг, 2). Иногда между железами располагаются резко расширенные синусоподобные образования (фиг. 5), местами образуя лакуны. Но связь между приводящими и отводящими отделами МКР слизистой оболочки осуществляется не только через капиллярные сети, синусы, а также через анастомозы между пре- и посткапиллярами, но и непосредственно через венулу и артериолу у основания желез по типу полушунта.Помимо выявления пространственной организации микроциркуляторного русла слизистой оболочки и его звеньев, была дана также его количественная характеристика. С этой целью применен стереометрический метод с помощью окулярной сетки, имеющей измерительную линейку, позволяющей одновременно провести и линейные вычисления. Определяли длину и диаметр отдельных звеньев и подсчитывали среднеарифметические значения с выведением критерия достоверности по Стьюденту. Вычисляли также радиус диффузии по формулеоя й=кйгде М - количество желез в ед, площади, Кроме того, стереометрическим методом по принципу точечных полей определяли объемную плотность капилляров, Поскольку плотность капилляров служит показателем потребности в кровотоке и коррелирует с метаболической активностью, здесь нужно указать, что благодаря заявляемому методу создается возможность установить состояние метаболических процессов путем определения активности АМФ-азы (фиг. 6) и выявить более адекватные коррелятивные зависимости между кровоснабжением и метаболическими сдвигами. С радиусом диффузии б, который информирует о степени снабжения тканей кислородом, тесно связан и другой показатель, как степень капилляризации, причем оба показателя находятся в обратно пропорциональной зависимости.Наши вычисления показали, что длина артериолы равняется 72,6 й 27,7 мкм, а ее диаметр составляет 14,1 + 8,1, Венулы более тонкостенные и с более широким просветом, Их длина и диаметр соответственно равны 124,3 + 30,1 мкм и 28,314,7, При определении плотности капилляров и капиллярных сетей установлено, что она равна 1,0 + 0,3 мкм в кубе, диаметр капилляра5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55- 6,4 2,4 мкм, а степень капилляризациив ед, площади составляет 0,009 . 0,001,Ниже приводятся примеры конкретноговыполнения способа на больных, Всего было исследовано 20 случаев,П р и м е р 1, Б-ная Акопян Бахча Максютовна, история болезни 153/64 - 1990 г.Гистологическое исследование М 1938 - 58,Клинический диагноз: Аденокарцинома селезеночного изгиба ободочной кишки Т 4;йх; Мо; Рз; С 12. Операция - резекция левых отделов ободочной кишки с трансверзосигмоидным анастомозом "бок в бок",Жалобы: периодические боли и вздутиеживота, плохой аппетит. Больна около шести месяцев, При эндоскопическом исследовании установлено циркулярноеопухолевидное образование с бугристой поверхностью, плотной консистенции, приконтакте кровоточит. Слизистая дистальнееопухоли розовая, сосудистый рисунок прослеживается, складки обычные,Заключение: инфильтративная формаэндофитно-циркулярной бластомы селезеночного изгиба ободочной кишки, При поступлении со стороны крови; гемоглобин114,0, эритроциты - 3,4, цветной показатель:,1, лейкоциты - 10, СОЭ - 20. Со сторонымочи патологии нет, Биохимические анализы показали повышение аминотрансферазАСТ - 100(0 - 40), АЛТ - 79(0 - 40), креатинин -139 (60 - 115). Остальные показатели в норме, Кислотно-щелочной баланс в пределахнормы. Резецированная кишка с опухольюпослана на гистологическое исследование,После макроскопического изучения препарата были взяты куски слизистой оболочки,расположенной дистальнее опухоли на расстоянии 25 см, Взятые куски имели размерв 1 см., фиксировались в смеси 12нейтрального формалина и ацетона в равныхсоотношениях в течение 10 мин. Срез толщиной в 10 мкм поместили в инкубационную среду следующего состава 10 мл 20 р-рамединала, 5 мл 20 хлористого кальция и 76мг аденозин-монофосфата (субстрат) притемпературе 37 гр, в течение 40 мин, Послепромывания в трех порциях воды обработали разведенным р-ром желтого сульфидааммония, снова промыли, просветлили и заключили в желатину,На препаратах, обработанных и окрашенных по вышеописанному способу, выявлено, что основной коллектор сосудистогорусла расположен в подслизистой соединительной ткани в виде крупнопетлистой сетис приводящими и отводящими отделами(фиг. 1). Отходящая от коллектора артериола,разветвляясь, проходит по основаниюжелез, и, повторно, давая многочисленные ветви, огибает боковые поверхности железистых структур (фиг, 3). Выявлена также капиллярная сеть, отходящая от прекаппиляров одной железы и от посткапилляра соседней (фиг. 4), Нужно указать, что перед тем, как провести обработку и окраску на МКР, было проведено контрольное изучение слизистой оболочки на предмет выявления патологических изменений и была установлена нормальная картина в этой зоне.П р и м е р 2, Б-ная Манукян Дора Степановна, история болезни М 88/39 - 1990 г. Поступила в отделение хирургии толстой кишки НИИ проктологии МЗ Арм. ССР 26.02.90, Обратилась с жалобами на боли в правой половине живота, ректальные кровотечения темной кровью во время дефекации, Б-ная была обследована, Проведен весь комплекс клинико-лабораторных исследований, включая сонографию и эндоскопическое исследование, По данным эндоскопии в области печеночного изиба имелось опухолевидное образование с бугристой изъявленной поверхностью, Слизистая нижних отделов толстой кишки розовая, сосудистый рисунок сохранен, складки обычные, спавшиеся,На основании проведенного комплексного обследования поставлен диагноз: аденокарцинома с/3 восходящей кишки Т 4; йх; Мо; Рз; С 2, 13,03,90 была произведена операция М 68 - правосторонняя гемиколэктомия с илеотрансверзоанастомозом "бок в бок". Со стороны крови отклонений не отмечалось, за исключением некоторых сдвигов электролитного гомеостаза, Со стороны мочи и биохимических показателей существенных изменений не наблюдалось.Резецированная кишка с опухолью была послана на гистологическое исследование. После макроскопического изучения макропрепарата были взяты кусочки со слизистой оболочки, находящейся на расстоянии 25 см от края опухоли, величиной 1 см и в количестве трех, Гистологическое исследование - М 1396 - 1412. Один кусок обработан и окрашен для экспресс-диагностики на предмет выявления патологических изменений со стороны эпителия желез и стромы, После контрольного исследования и установления нормального состояния слизистой в указанной зоне (на 25 см от края опухоли) провели изучение МКР, Кусочки были фиксированы в смеси из равных объемов 12 нейтрального формалина и ацетона в течение 10 мин. Срезы толщиной 8 мкм поместили в инкубационную среду, имеющей состав: 10 мл 2 р-ра мединала, 5 мл 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2 фр-ра хлористого кальция и 76 мг аденозин-монофосфата (субстрат) при температуре 37 гр. в течение 40 мин. После промывкив трех порциях воды обработали разведенным р-ром желтого сульфида аммония, снова промыли, потом просветлили изаключили в желатину,При микроскопическом исследованииустановлено, что основной коллектор представлен стволовыми артериолой и венулой,проходящими параллельно друг другу и находящимися в соединительнотканной основе ближе к ос но ва н и ю желез (фиг, 2),Артериола имеет обычно извитой ход, местами дает расширения, чередующиеся с сужениями просвета, Выявлен анастомозмежду венулой и артериолой, короткий ввиде полушунта. В межжелезистой соединительной ткани встречались зоны, где довольно густо расположенные пре - ипосткапилляры, разветвляясь, образовывали крупнопетлистую сеть (фиг, 4). Иногдамежду железами располагались резко расширенные синусоподобные образования(фиг. 5),Из вышеизложенного следует, что предлагаемый способ для выявления сосудистого русла слизистой оболочки толстой кишкиобладает рядом преимуществ. Использование заявляемого изобретения позволяет:- выявить МКР в слизистой оболочкетолстой кишки со всеми его звеньями (фиг,1, 3) - б-ная Акопян Б.- дать количественную оценку пространственной организации терминальногозвена кровоснабжения (определены диаметр и длина отдельных звеньев МКР, плотность капилляров и степенькапилляризации в ед. объема и площади ткани во всех излучаемых случаях).- повысить качество обработки в планевыявления мельчайших капилляров и синусов (фиг, 4, 5) - б-ная Манукян Д.- сократить время проведения способа.Если в близком по сущности к заявляемомуизобретению способе фиксация, обработкаи окраска требуют около 52 часов, то в заявляемом способе все этапы длятся всего 2часа.- установить одновременно без дополнительных затрат времени и реактивов активность фермента АМф-азы, играющегозначительную роль в энергетических процессах и имеющего прямую связь с кровоснабжением (фиг. 6) - б-ной Григорян А.Формула изобретенияСпособ подготовки материала слизистой оболочки толстой кишки для гистологического исследования ее сосудистого руслапутем его фиксации, приготовления срезови помещения их в инкубационную среду, промывания, обработки реактивами с последующей промывкой и окрашиванием материала, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, повышвния точности, исследования, фиксацию проводят в смеси формалина и ацетона, взятых в соотношении 1:1, а инкубацию в среде, содержащей 0,2%-ный раствор аденозин-монофостата, 2 о-ный раствор мединала и 2;-ный раствор хлористого кальция в соотношении 7;2:1 при температуре 37 С в течение 40 мин, затем промывают трехкрэтно в 1%-ном растворе хлористо го кальция, помещают его в 2 о,-ный раствор хлористого кобальта и после промывки дистиллированной водой проводят окраску в 50 мл 5 О-ного раствора сульфидэ аммония, просветляют и заключают 10 в желатину,1807397.ФСоставитель Э.Манукян Редактор С. Кулакова Техред М,Моргентал Корректор Н,Ревска аказ 1376 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж. Раушская наб 4/510Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гага