Способ определения биологической неэквивалентности химически идентичных органических азотсодержащих лекарственных веществ

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ОО Ф О Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам торскому свидетельству(56) Авторское свидетельство СССР Х1200440, кл, А 61 К 31/00, 1988.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ХИМИЧЕСКИ ИДЕНТИЧНЫХОРГАНИЧЕСКИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ(57) Изобретение относится к области фармации. Цель изобретения - повышение достоверности способа за счет оценки цифровых показателей - достигается тем, что по спектрам ядерного магнитного резоинанса С высокого разрешения испытуемого и стандартного образцов идентичного лекарственного вещества измеряют величину отклонения резонансов ядер атомов углеродаиспытуемого образца относительно стандартного и по результатам судят о его биологической неэквивалентности. 5 табл.Изобретение относится к области фармации, в частности к способу определения биологической неэквивалентности идентичных органических азотсодержащих лекарственных веществ и может быть использовано при контроле качества лекарственных средств в химико-фармацевтической промышленности и медицине.Известно, что химически идентичные лекарственные средства разных изготовителей, а часто разные партии одного и того же изготовителя могут проявлять неодинаковые физико-химические, биофармацевтические 6 п что, ш л 1 го) и терапевтические свойства. Это явление получило название биологической неэквивалентности.Основной причиной бионеэквивалентности лекарственных средств при одинаковом химическом составе и чистоте являются кристаллические и конформационные изменения лекарственного вещества.Кристаллическое и конформационное состояние молекул лекарственных веществ связаны с технологическими процессами их получения. Незначительные специфические отклонения от стандартной технологии могут привести к изменению молекулярного состояния лекарственных веществ и, как следствие, к отклонению их биологической активности от биологической активности стандартных лекарственных веществ (за стандартное лекарственное вещество принимают лекарственное вещество, полученное по утвержденной стандартной технологии). Однако, анализ качества лекарственных веществ, полученных по измененной технологии, часто показывает полное соответствие их требованиям фармакопеи. Это свидетельствует о том, что известные методы контроля не гарантируют качества препаратов. Биологическая неэквивалентность лекарственных средств приводит к тому, что препарат, отвечая всем требованиям соответствующей нормативно-технической документации, в том числе Государственной Фармакопее СССР Х 1 издания, проявляет или снижение терапевтического эффекта, или гиперэффект.В связи с изложенным, необходимость разработки экспрессных методов выявления биологической неэквивалентности идентичных лекарственных веществ является чрезвычайно актуальной,В настоящее время известен способ определения неэквивалентности идентичных лекарственных средств с применением метода рефрактометрии. Способ заключается в том, что измеряют показатели преломления испытуемого и стандартного образцов на рефрактометре и по отклонению показателя преломления испытуемого образца от показателя преломления стандартного образца устанавливают наличие неэквивалентности.Указанный способ характеризуется необходимостью одновременного определения показателя преломления стандартного и испытуемого образца, что усложняет методику.Наиболее близким к предлагаемому является способ определения неэквивалентности идентичных азотсодержащих лекарственных веществ. Способ заключается в том, что готовят растворы испытуемого и стандартного образцов равной концентрации и к ним добавляют раствор комплексообразователя, в качестве которого используют гетерополикислоты. Изменение интенсивности окрашивания раствора, а также образование осадка свидетельствует о неэквивалентности испытуемого образца.Указанный способ характеризуется невысокой достоверностью определения биологической неэквивалентности, так как основан на субъективном методе определения результатов по изменению цветовой окраски растворов, возникающей в результате химической реакции взаимодействия лекарственного вещества с комплексообразователем.Целью изобретения является повышение достоверности способа за счет оценки множественных цифровых показателей.Указанная цель достигается тем, что в способе определения биологической неэквивалентности идентичных органических азот- содержащих лекарственных веществ, включающем исследование пробы и стандарта с последующим определением отклонений результатов от стандарта, согласно изобретению, исследование проводят по оценке характеристик спектров магнитного резонанса ядер атомов углерода.Предлагаемый способ отличается тем, что используется новая методика определения биологической неэквивалентности, основанная на измерении по спектрам ядерного магнитного резонанса С высокого разреше 13ния отклонений испытуемого от стандартного образца идентичного лекарственного вещества посредством вычисления различий цифровых величин резонансов ядер атомов углерода, например, химических сдвигов этих образцов и определении биологической неэквивалентности испытуемого образца по отношению к стандартному по величине отклонений. Это позволяет повысить достоверность методики определения биологиче 1788849ской неэквивалентности, так как она основывается на сопоставительном анализе множества цифровых величин характеристик спектра, а не на субъективной оценке результатов только по одной характеристикецветовой окраске, что имеет место в известном способе,На основании проведенных исследований авторами выявлена взаимосвязь между параметрами спектров ядерного магнитного резонанса1 зС высокого разрешения лекарственных веществ и их биологической активностью и установлено, что химические сдвиги спектров ядерного магнитного резонанса С высокого разрешения идентичных13лекарственных веществ имеют отличия при их биологической неэквивалентности.Измерение спектров ядерного магнитного резонанса С высокого разрешения известно1 зи используется при анализе лекарственных веществ. Однако в заявляемом способе сопоставление спектров ядерного магнитного резонанса С высокого разрешения позволя 13ет достичь новый эффект, а именно, при сравнении характеристик спектров одних и тех же идентичных лекарственных веществ определить их биологическую неэквивалентность.Для установления наличия биологической неэквивалентности поводят сопоставление характеристик спектров ядерного магнитного резонанса С высокого разрешения испыту 13емого и стандартного образца органических азотсодержащих лекарственных веществ. Заявляемый способ пригоден для определения биологической неэквивалентности любых органических азотсодержащих лекарственных веществ. Измерение спектров ядерного магнитного резонанса С испытуемого и13стандартного образцов проводят в идентичных условиях по известной методике на любых пригодных устройствах (спектрометрах),По полученным спектрам испытуемого и стандартного образцов одного и того же идентичного лекарственного вещества проводят сравнительный анализ и по отклонению положения резонансных сигналов, например, величин химических сдвигов однотипных атомов углерода испытуемого образца относительно стандартного судят о его биологической неэквивалентности, Заявляемый способ позволяет экспериментально для каждого лекарственного вещества установить меру (степень) биологической неэквивалентности в зависимости от конкретных отклонений цифровых показателей спектров ЯМР 13 С В дальнейшем изобретение поясняется конкретными примерами осуществления заявляемого способа.Пример 1. Для определения биологической неэквивалентности берут стандартный и испытуемый образец идентичного лекарственного вещества - метилурацила (2,4-диоксо-б-метил, 2, 3, 4-тетрагидропиримидина).Метилурацил, используемый в качестве испытуемого образца, получен согласно методике, заключающейся в кристаллизации метилурацила из водного раствора.Испытуемый и стандартный образцы метилурацила идентичны, соответствуют требованиям Госфармакопеи СССР (ФС 42- 2254-84). В идентичных условиях по известной методике с помощью серийного ЯМР-спектрометра ЧХВ.-ЗОО, фирмы "Чапап" (США) измеряют спектры ядерного магнитного резонанса С высокого расширения13испытуемого и стандартного образцов метилурацила или используют в качестве стандарта ранее полученные спектральные данные, Параметры спектров ЯМР высокого1 зразрешения представлены в табл, 1.Из данных табл. 1 видно, что все сигналы испытуемого образца смещены относительно сигналов стандартного образца на 1 - 4 м.д. При диапазоне указанных химических сдвигов и межлабораторной точности, лежащей в интервале от +1,0 до 0,01 м.д суммарный эффект различий, представляющий количественную оценку неэквивалентности испытуемого образца относительно стандартного, составляет 14 м,д.Для подтверждения биологической неэквивалентности испытуемого образца стандартному образцу параллельно проведено изучение влияния этих образцов метилурацила на заживление линейных ран у крыс.Определение биологической неэквивалентности образцов метилурацила на модели линейных ран (7).Опыты проводят на 21 белой беспородной крысе (самцы) массой 180 - 220 г. Экспериментальной моделью служат линейные раны длиной 50 мм, которые наносят на спины крыс, Животных разделяют на 3 серии, Первая серия - контрольная - раны обкалывают 1 раз в день физиологическим раствором в количестве 0,5 мл в течение 3-х дней, Во второй серии раны обкалывают по той же методике 1;4 раствором стандартного образца метилурацила в физиологическом растворе. В третьей серии раны обкалывают по той же методике 0,25;4 раствором испытуемого образца метилурацила в физиологическом растворе. Выбор концентраций7 1 обусловлен предварительными испытаниями, где было показано, что ранозаливляющий эффект стандартного образца метилурацила проявляется лишь при использовании раствора с концентрацией 1 , а сравниваемый ранозаживляющий эффект испытуемого образца метилурацила проявляется при использовании раствора с концентрацией 0,25.Ранозаживляющую активность образцов метилурацила оценивают по прочности рубца на растяжение. Получены следующие результаты. В 1-ой серии 30,1 1,3 г/мм, во 11-ой - 40,1+5,0 г/мм и в П 1-ей 57,3.9,0 г/мм, Из указанных результатов видно, что применение стандартного образца метилурацила увеличивает прочность рубца на 33,2 , а испытуемого образца, в концентрации в 4 раза меньшей, на 90,40,.Сравнительные данные, характеризующие биологическую неэквивалентность испытуемого образца метилурацила при наличии отклонений химических сдвигов ЯМР С испытуемого образца относительно стандартного, представлены в табл, 2,Данные табл. 2 доказывают биологическую неэквивалентность испытуемого образца стандартному, при наличии отклонений химических сдвигов ЯМР С испытуемого13относительно стандартного, а именно, испытуемый образец (при наличии отклонений химических сдвигов ЯМР С относительно13стандартного) имеет более высокую биологическую активность (ранозаживляющий эффект); увеличивает прочность рубца на 90,4; при концентрации в 4 раза меньшей, чем у стандартного образца.Пример 2. Для определения биологической неэквивалентности берут стандартный и испытуемый образец идентичного лекарственного вещества - стрептоцида (и-аминобензолсульфамида),Стрептоцид, используемый в качестве испытуемого образца, получен согласно методике, заключающейся в диспергировании раствора стрептоцида в хладагенте с последующей его сублимационной сушкой, Испытуемый и стандартный образцы стрептоцида идентичны, соответствуют требованиям Госфармакопеи СССР (ст. 633 ГФ Х изд.)По известной методике с помощью серийного ЯМР-спектрометра ЧХК-ЗОО, фирмы "Чаг 1 ап" (США) измеряют спектры ядерного магнитного резонанса С высокого13разрешения испытуемого и стандартного образцов стрептоцида, Полученные из спектров ЯМР С высокого разрешения данные3представлены в табл. 3. 788849Из данных табл, 3 видно, что все сигналыиспытуемого оЬразца смещены относительно сигналов стандартного образца. При диапазоне указанных химических сдвигов суммарный эффект различий, представляющий количественную оценку неэквивалентности испытуемого образца относительно стандартного составляет 6 м.д. Для подтверждения полученных результатов проведена биологическая оценка неэквивалентности испытуемого и стандартного образцов сгрептоцида в опытах на кроликах посредством определения и сравнения концентраций свободного стрептоцида в крови после его перорального приема.Определение биологической неэквива 1 ентности образцов стрептоцида в фармакокинетических опытах на кроликах.В двух сериях опытов (по 5 кроликов вкаждой) животным перорально вводят 21 мл 0,46;4 водного раствора испытуемого и стандартного образца сгрептоцида. Растворы готовят непосредственно перед введением.Через 0,5; 1; 2; 4; 6 часов после введения растворов из краевой ушной вены кроликов берут по 1 мл крови в 15 мл воды. По окончании гемолиза добавляют 4 мл 15 , трихлоруксусной кислоты. Смесь перемешивают и фильтруют. В 2,5 мл фильтрата фотоколориметрическим методом при зеленом светофильтре определяют оптическую плотность раствора, а затем по калибровочному графику содержание стрептоцида.Содержание стрептоцида в 1 мл кровивычисляют по формуле:СЧКХ мкг/мл =Ч а1где С - концентрация стрептоцида, найденная по графику;Ч - общий объем раствора (15 мл воды + 1 мл крови + 4 мл 15 , трихлоруксусной кислоты);К - количество крови, на которое проводят расчет;Ч 1 - взятый объем фильтрата на анализ (2,5 мл);а - количество крови в опыте (1 мл).Результаты экспериментов представленыв табл. 4.Анализ эксперимента 1 ьных данных (табл.4) показывает существенные различия в фармакокинетических показателях, особенно на стадии всасывания. В период всасывания концентрации стрептоцида в крови испытуемого образца значительно превышают таковые у стандартного образца.Сравнительные данные, характеризующие биологическую неэквивалентность испы1788849 10 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Таблица 1Химические сдвиги ЯМР С стандартного и испытуемогоВобразцов метилурацила Химические сдвиги, м,д. Параметр 3 стандартного-4, 2 -2 3 -0,8 туемого образца стрептоцида стандартному при наличии отклонений химических сдвигов ЯМР С испытуемого образца относительно13стандартного, представлены в табл. 5.Данные табл, 5 показывают, что при наличии отклонений химических сдвигов ЯМР С испытуемого образца относительно стандартного подтверждается биологическая неэквивалентность испытуемого образца стандартному, выраженная в повышенной биологической активности (содержание стрептоцида в крови в период всасывания у испытуемого образца значительно выше).Применение предлагаемого способа позволяет повысить достоверность методики Способ определения биологической неэквивалентности химически идентичных органических азотсодержащих лекарственных веществ, включающий исследование пробы и стандарта с последующим определением отклонений результатов от стандарта, отлиопределения биологической неэквивалентности идентичных лекарственных веществ, так как основывается на сопоставительном анализе множественных измеряемых параметров спектра в виде цифровых величин, а на субъективной оценке результатов по цветовой окраске, что имеет место в известном способе (прототипе). Кроме того, заявляемый способ характеризуется упрощенной методикой определения биологической неэквивалентности, так как исключает химические реакции взаимодействия, используемые в известном способе. чающийся тем, что, с целью повышения достоверности способа за счет оценки цифровых показателей, исследование проводят по оценке параметров спектра магнитного резонанса ядер атомов углерода.1 г 1788849 Таблица 2 Сравнительные данные биологической неэквивалентности испытуемого образцаметилурацила стандартному (при наличии отклонений химических сдвиговЯМР С испытуемого относительно стандартного) Параметр Химические сдвиги,м.д, Оценка биологической активности 170,8 158 ф 7 151,4 98,8 19,3 167,2 155,6 155,6 101,1 20,1 1,0 0,25 Та бли ца 3бХимические сдвиги ЯИР С стандартного и испытуемогообразцов стрептоцида Химические сдвиги, м.д,Ф Параметр с 0" стандартного(с 293 К) 153,4 129,2 126,7 116,8 111,9 151,9 127,9 126,8. 115,0 113,1 Характеристические отличиялд испытуемого от3 стандартного 1 5 1 3 -0 1 1 8 -1 2 Таблица 4Содержание стрептоцида в крови (мкг/мл) через указанный промежуток временивведения растворов испытуемого и стандартного образцов Время, час Образцы 0,5 1. Раствор стандартного образца стрептоцида 23,86+1,87 6,1210,73 3,50+0,15 2,27+ 0,11 1,60+0,02 2, Раствор испытуемого образцастрептоцида 38,94+3, 23 12, 93+ О, 49 6, 02+0,94 6,4 1+1,62 2,22;С 1,85 1 стандартного14 1788849 13 Таблица 5 Сравнительные данные биологической неэквивалентности испытуемого обоазца стрептоцида стандартному.ю. 1 при наличии отклонений химических сдвигов Я(1 Р С испытуемого относительно стандартного)Оценка биологической активности ПараметР Химические сдвиги, м,д. 0,5 ч 1 ч 2 чч 6 и 153,ц 129,2 1 г 6,7 116,8 111,9 О,ч 6 1 ОО 151,9 127,2 126,8 115,0 113,1 О,Й 6 162 Заказ - 6 ф,4- Подписное ВНИИПИ, Рег, ЛР Мя 040720 113834, ГСП, Москва, Раушская наб.,4/5