Способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы

карельской березы, Способ включает четыре этапа; введение в культуру верхушечных и пазушных почек и инициация роСта каллуса на среде Мурасйге и Скуга (МЯА) с 10 1 мг/л БАП в течение двух недель; индукция почкообразования на среде с 10 мг/л БАП, 0,2 мг/л НУК в течение 2-3 недель; удлинение побегов на среде МЯ с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей, 0,5 мг/л 15 . БАП, 0,5 мг/л ИУК втечение четырех недель; укоренение на среде МЯ с половинным содержанием макросолей и сахарозы, без гормонов в течение четырех недель. 20 вышенное использование БАП на второмэтапе (10 мг/л) может вызвать нежелатель 40 50 55 селекции В.И. Ермакова не дала положительных результатов.Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ клонального микроразмножекия взрослых растений свилеватой Недостатками данного способа являются многоступенчатость технологии (4 этапа), что связано с дополнительными экономическими и временными затратами (12-13 недель), относительно низкий процент укореняемости и приживаемости растений при высадке в открытый грунт, высокий процент инфицирования и гибели регенерантов ка этапах культивирования, Кроме того, поные изменения в генотипе, а длительность укоренения без гормонов (до четырех недель) нежелательна для развития побегов,Целью изобретения является увеличение выхода растений - регенерантов гибридов карельской березы и сокращениесроков выращивания,Цель достигается тем, что согласно способу клонального микроразмножения гибридов карельской березы в качестве исходных эксплантов используют верхушечные.и пазушные почки гибридов карельской березы, рост каллуса и формированйе конгломерата микропобегов проводят на основной агаризованной питательной среде по Мурасиге и Скугу с добавками 80 - 120 мг/л лизина, 0,05-0,15 мг/л кинетина, 0,6- 1,0 мг/л БАП (бензиламинопурина), 0,050,08 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота) (среда 1), с последующим субкультйвированием и удлинением побегов на основной агаризованной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и сахарозы и с дополнением 0,4-0,6 мг/л БАП, 0,3 - 0,5 мг/л ИУК(среда 2), укоренение растений - регенерантов проводят на основной жидкой питательной среде с дополнением 0,4 - 0,6 мг/л ИМК (индолил-масляная кислота), НУК 0,1-0,3 мг/л (среда 3). Культуры выращивают при освещении люминесцентными лампами (10000 лк) на 16-часовом фотопериодепри 25 С и относительной влажности воздуха 70%. Укорененные растения-регенеранты высаживают в почву в теплицу споследующей высадкой в открытый грунт,Способ осуществляют следующим образом.Молодые неодревесневшие побеги текущего года длиной 3-5 см обмывают в слабом мыльном растворе, а затем промываютводопроводной водой, Растительный материал Сначала стерилизуют в ламинаре в течение 1 мин в 70% этаноле, а затем - 3 минв диациде, По окончании стерилизации промывают трехкратно автоклавированной дистиллированной водой.В стерильных условиях вычленяют пазушные почки и помещают в питательнуюсреду в пробирки. Среда 1 для куль.ивирования почек с последующим образованиеми ростом каллуса содержит, кроме основнойсреды по Мурасиге и Скугу (МигазЫце,51 ооц, 1962), 80-120 мг/л лизина, 0,050,15 мг/л кинетина, 0;6-1,0 мг/л БАП; 0,05 -0,08 мг/л НУК, сахарозу 20 г/л, агар 0,4%.На этой среде через.три недели образуетсяплотный каллус желтовато-бурого цвета, Через две недели он увеличивается в массе инаблюдается многочисленное образованиепочек зеленого цвета с последующим появлением укороченных побегов с молодымилистьями, Затем этот каллус с образовавшимся конгломератом глаленьких побеговпереносят на среду 2, на которой происходит удлинение побегов в течение 3-4недель. Среда 2 с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей содержит 0,40,6 мг/л БАП и 0,3 - 0,5 мг/л ИУК, 10 г/лсахароэы и 0,4%-ный агар, На среде 2 проводят мультипликацию побегов, т, е., помещая выросшие побегй, подрезав соснования и удалив верхушку, на свежуюсреду, можно; повторяя этот процесс многократно, добиться выхода максимального5 числа побегов из одного экспланта.Выросшие до 2,0 - 3,0 см растения пересаживают на жидкую питательную среду 3для корнеобразования. Эта среда состоитиз минеральных солей по Мурусиге и Скугус добавками лизина 80 - 120 мг/л, ИМК 0,40,6 мг/л, НУК 0,1 - 0,3 мг/л, сахарозы 20 г/л;На этой среде побеги формируют корни втечение 10-15 дней, По достижении корнями 3-5 см в длину растения пересаживаютв почвенную смесь с торфом. Горшки с растениями ставят в теплицу для доращивания,Способ апробирован в лабораторнопроизводственных условиях,П р и м е р 1. Материалом для размножения служат гибриды карельской березы,10 15 НУК 0,065 мг/л (оптимальные концентрации) 20 автоклавировали при 1 атм в течение 30 мин, воду - при 1,5 атм в течение 1 ч, Эксйланты помещают на питательную среду 1 в биологлческие пробирки(21 х 200 мл), которые закры 25 30 субкультивируют на среде для элонгации .35(оптимальные концентрации), сахарозы 50 20 г/л. По достижении корнями 3 - 5 см в длину растения пересаживают в почвенную смесь с торфом. Горшки с растениями ставят в теплицу для доращивания. Полив обильный, Приживаемость растений со ставляет 76%. Наблюдения показывают нормальный рост и развитие растений,Сравнение результатов каллусообразования показывает, что процент каллусообразования у предложенного способа полученные под руководством В.И. Ермакова и произрастающие на агробиостанции. Пазушные почки взяты со взрослых деревьев, возраст которых 18 - 23 года,Молодые неодревесневшие побеги длиной 3 - 5 см отрезают, поверхностно стерилизуют в растворе детергента, а затем промывают в проточной воде. В стерильных условиях (в ламинаре) кусочки побегов сначала стерилизуют в течение 1 мин в 70%- ном этаноле, а затем в диациде 3 мин, По окончании стерилизации промывают трех- кратно автоклавированной дистилированной водой. После этого в стерильных условиях (шкаф с ламинарным течением воздуха) отделяют почки от побегов, удаляют у них покровные чешуи, Пробирки со средой 1 (табл. 1) с добавками лизин100 мг/л, кинетин 0,1 мг/л, БАП 0,85 мг/л,вают стерильными марлевыми пробками. Пробирки помещают на светоплощадку при освещении люминесцентными лампами (10000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25 С и 70% относительной влажности воздуха. Через три недели на нижней части почки образуется каллус желто-бурого цвета, который, спустя 2 недели, увеличивается в массе, наблюдается массовое образование почек зеленого цвета. Этот каллус далее побегов,Для элонгации побегов используют среду 2 (табл. 1), которая представляет собой основную среду с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и с дополнением 0,5 мг/л БАП и 0,4 мг/л ИУК (оптимальные концентрации), сахарозой 10 г/л и агаром 0,4%, На этой среде проводят мультипликацию побегов, Побеги гибридов, достигшие 2,0 - 3,0 см, в течение трех недель пересаживают на жидкую питательную среду 3 для корнеобразования (табл, 1), состоящую изминеральныхсолей по Мурасиге и Скугу с дополнением ИМК 0,5 мг/л, НУК О,2 мг/л 40 45(83,6%) выше, чем даже на лучшей из среддля инициации каллуса (МЯА) у известного (82,7%).На этапах культивирования (этапе 1 4) у известного способа случаи бактериального инфицирования и гибели составляют40-101%, В предложенном способе инфицирования и гибель эксплантов наблюдается только на этапе 1 (табл. 2), что составляетв среднем 16,4%, на этапах органогенеза(этапы 2 - 3) инфицирования и гибели регенерантов не наблюдают (табл, 3).Сравнение результатов укоренения ичего показывает, что предложенный способпозволяет достигнуть укорененияи всго удеревьев всех испытанный гибридов (например, у гибрида 32 из 32 побегов 22укореняются сразу на среде 3, а 10 инертных побегов после повторного помещенияна среды 2, 3 тоже дают корни). в тоже времяу известного способа укоренение 1 и ч 11 годостигнуто не у всех деревьев и процентукоренения низок из-за инфицирования игибели регенерантов на этапах 2-4 (40101%);В предложенном способе приживаемость растений, высаженных в грунт, составляет в среднем 76%, в известномспособе данные по приживаемости не приводятся,Предложенный способ позволяет проводить культивирование взросль 1 х деревьевкарельской березы в укороченные сроки 1011 недель (известный способ 12-13 недель)за 3 этапа (табл. 4),П р и м е р 2, С молодых неодревесневших зеленых побегов отделяют пазушныепочки и культивируют их на питательнойсреде 1 с различными концентрациями гормональных веществ. В процессе экспериментов выявлены предельные значения иоптимальные концентрации кинетина, БАП,ИУК, НУК, лизина соответственно. Результаты представлены в табл. 5-8.П р и м е р 3. Растительный материалтот же, что и в примере 1 и 2. Послекультивирования на среде 1 полученныемножественные микропобеги отделяли исубкультивировали индивидуально на среде2 с разли(ными концентрациями БАП и ИУК,с целью удлинения. Экспериментально определяют предельные й оптимальные концентрации БАП и ИУК соответственно.Результаты представлены в табл. 9 и 10.П р и м е р 4. После культивированияна средах 1 и 2 выросшие микропобегипересаживают на среду 3 для стимулировайия образования корней с различными концентрациями ИМК, Экспериментальноопределяют предельные значения и оптимальные концентрации ИМК. Результаты приведены в табл, 11,В культуру вводят растения нескольких гибридных комбинаций. Преимуществами предлагаемого способа являются: возможность промышленного использования в лесном хозяйстве уникальных гибридов карельской березы с ценной древесиной, которые ранее не могли быть использованы в производстве вследствие трудности их размножения черенкованием; возможность размножения взрослых деревьев; воэможность многократной мультипликации; сокращение сроков полученияукорененных растений до 10-11 недель; подготовка укоренившихся растений в условиях теплицы к началу вегетации в открытом грунте; возможность выращивания посадочного материала независимо от времени года. Среды, используемые для клональногомикроразмножения гибридов карельской березы, представлены в табл. 1.Результаты каллусообразования у предложенного и известного способов представлены в табл. 2.Результаты размножения гибридов карельской березы (сентябрь-октябрь 1988 г,)представлены в табл. 3,Этапы.культивирования и их длительность у предложенного и известного способов приведены в табл, 4.Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации кинетина приведены в табл. 5.Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации БАП представлены в табл. 6.. Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации НУК приведены в табл. 7. Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зави. симости от концентрации лизина приведеныв табл, 8,5 . Результаты удлинения побегов в эависймости от концентрации БАП приведены втабл, 9.Результаты удлинения побегов в зависимости от концентрации ИУК приведены в10 табл. 10.Эффективность корнеобразования в зависимости от концентрации ИМК приведенав табл, 11.15 Формула изобретенияСпособ клонального микроразмножения гибридов карельской березы, включающий посев верхушечных и пазушных почекна агаризованную питательную среду Мура 20 сиге-Скуга, содержащую в своем составефитогормоны, культивирование до получе-ния побегов, их удлинение на питательнойсреде Мурасиге-Скуга с уменьшенной вдвоеконцентрацией макросолей и содержащей в25 качестве фитогормонов 6-бензиламинопурин и индолилуксусную кислоту с последующим переносом на питательную среду дляукоренения, отл ича ющий с я тем, что,с целью увеличения выхода растений-реге 30 нерантов и. сокращения сроков выращивания, посев верхушечных и пазушных почекпроводят на питательную среду, содержащую в качестве фитогормонов 80 - 120 мг/ллизина, 0;05-0,15 мг/л кинетина; 0,635 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина и 0,050,08 мг/л НУК, субкультивирование побегови их удлинение проводят на питательнойсреде при концентрации 6-бензиламинопурина 0,3-0,5 мг/л и индолилмасляной40 кислоты. 0,3-0 5 мг/л, а укоренение осуществляют на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей дополнительно0,4-0,6 мг/л индолилмасляной и 0,1 -0,3 мг/л нафтилуксусной кислоты.1752284 10 мг/л Среда и ет и и и т Ъа 1650 Умень- - +шеннаявдвоеконцен- +трация 190.0 440 370170 37,3 27,8 6,222,3 8,6 0,83 ИаМоО 2 НО Сц 80 5 НО СоС 1 6 НО 0,250,0250,02520000 0,5 Пиридоксин НС 1Тиамин НС 1ИнозитГлицин 0,1 00 2,0 80120 Лизин 0,0-0,1 Кинетин О,б 1,0 0,11-0,6 БАЛ ИУК 0,3 и 0,5 НУК 0,4-0,6 ИМК ев ивеетевивеватеевитаю ее титаи и Состав основной средыпо Мурасиге и Скугу и ивиюг титави вата ветаате КНОСаС 1 2 НОМИ 804.7 Н 20КНдГОиМа ЭДТА 2 НОГе 80 7 Н ОН ВОаМ 80 4 Н,О2 п 80 7 Н 0КУ СахарозаНикотиновая кислотаа аи а тт в е аю и е в е е т щ и ет е иа е ив а а ю е теа е в Таблица 1и и е е в е и аи е е те в е а е в в и щ в и т а е т и титита еевитаюа щитааааа1 2 3е щ и и т и е е ав а е е Е е е и и е е е а юи1752284 12 Табли ца 2 Способ Известный Предложенный Среда ч232 ИВ1 1 ) Количество вводимых в культуру эксплантов, шт. 29 Количество образовавшихсякаллусов, шт 46 3 164 4 2483,63 253411 26,73 44,4 82,7 Процент каллусообразования Процент инфицирования и ги- бели эксплантов 16,4 :753 . 593 73,33 55,6 Ф 17,3 ФФП р и м е ч а н и е. 8 культуру вводились экспланты от 10-20 деревьев каждого гибрида,Здесь и в последующих таблицах даны данные по одному дереву откаждого гибрида, так как результаты по деревьям от одного гибри да не варьировали. 8 предложенном способе в культуру вводилисьэкспланты от трех гибридных комбинаций (32, 368, 589), в изве-стном - от пяти плюсовых деревьев (Е 8469, Е 8999, Е 9000, Е 9141,Е 1092). Таблица 3 Количество побегов от одного каллуса,шт Гибриды Высаженов грунт,шт Количествоускоренныхрастений 1 плСго, шт Прижилось вгрунте, шт Количество вве- Количество обденных в куль- разовавшихся туру эксплан- каллусов, шт тов, шт 22 29 20 32 41 29 22 29 20 1722 15 12 25 18 92314 32368589 П р и м е ч а н и е. Данные приводятся без учета процессов субкультивирования каллуса имультипликации побегов, которые позволяют многократно увеличиватьвыход растений - регенерантов от одного экспланта,Не укоренившиеся сразу побеги (32-22- 1 О у гибрида 32) не инфицируются и не погибают, а повторно помещаются на свежие среды 2 и 3,гле позднее дают корни. Инфицирования и гибели регенерантов наэтапах 2 и 3 не ваблюдалось,Таблица 4 Длительность этапов, не елиПредложенный Введение в культуру,каллусообразование,индукция почекЭлонгация побеговКорнеобразованиеВведение в культуру,каллусообразованиеИндукция почекЭлонгация побеговКо необ азование 10 - 11 3-422 Известный 2 - 344 12-13 Таблица 5ГбТаблица,б 1752284 блица 7 а а Таблица 0 бл Т и оставитель Р.Байбуринаехред М, Моргентал Корректор М,Демчик едактор Г.Ге Заказ 2710 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101