Способ микроклонального размножения лиственницы

духа) удаляют покровные чешуи с верхушечной почки и выделяют зачаточный побег, несущий меристему и листовые примордии. Изолированные эксплантаты помещают на агаровую питательную среду 1 в биологические пробирки или колбы. Среда 1 содержит минеральные соли, витамины, мезоинозит, а также 2 оь сахарозы, 0,6 О/ь агара и гормональные вещества: 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 0,5-1,5 мг/л и кинетин 0,5-2 мг/л (табл.1). В течение 4-7 недель на этой среде (у 53-81 О эксплантатов) происходит инициация пазушных почек, что выражается в набухании исходной почки, разрастании ее в ширину и образовании светло-зеленого диска диаметром до 10 мм, Полученные таким образом диски переносят на питательную среду 2, представляющую собой модифицированную по минеральному составу среду Соммера, лишенную регуляторов роста (табл,1), На этой среде в течение 4-5 недель происходит рост инициированных пазушных почек с образованием конгломерата коротких побегов длиной 1-3 мм (в среднем 16,7 побегов на 1 эксплантат), Сформированный конгломерат разделяют под микроскопом и каждый побег помещают на среду 3, являющуюся дилюированной вдвое по минеральному составу средой 2, к которой добавлена мочевина в концентрации 20-50 мг/л (табл.1). На этой среде происходит удлинение побегов, которые в течение 4-7 недель достигают длины 6-10 мм, Полученные таким образом побеги морфологически пригодны для стимуляции ризогенеза на укоренительных средах. Процесс клонирования составляет 85-130 дней от момента введения эксплантатов в культуру до получения удлиненных побегов,В табл,1 представлены среды, используемые для клональной мультипликации лиственницы в культуре изолированных вегетативных почеки ч 11 го,П р и м е р 1; Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в 3 срока: ноябре, феврале, апреле с 20-23-летних деревьев лиственницы Сукачева различного географического происхождения (30 клонов). Часть черенков, собранных в ноябре и феврале, находится под снегом (5 мес) и в холодильнике при 3 С (2 мес), после чего их используют для взятия эксплантатов, Наиболее крупные апикальные почки (5-6 мм) после стерилизации и удаления по- кровных чешуй культивируют последовательно на питательных средах 1, 2 и 3 со следующими оптимальными концентрациями добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л. мочевина 30 мг/л. Культуры выращивают на35455055 102030 светоплощадке при 16-часовом фотопериоде (освещение люминесцентными лампами2000-500 лк) при 26 С днем и 22 С ночьюПродолжительность культивирования на каждой из сред варьируют в зависимости от клонов от 4 до 6 недель, Различия в характере мультипликации в зависимости от сроков взятия и продолжительности хранения черенков не являются существенными(табл.2). Средняя эффективность образования дисков с пазушными почками (инициация пазушных меристем) 75 О/ среднее число побегов на 1 эксплантат 18,7, а максимальное 25, средняя длина побегов после удлинения 8,4 мм. Продолжительность процесса мультипликации 12-17 недель. П р и м е р 2. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в ноябре и апреле с 20-23-летних деревьев (20 клонов), Апикальные почки распределяют на 3 группы по их размерам; мелкие(1-2 мм), средние (3-4 мм) и наиболее крупные (5-6мм), затем культивируют отдельно при тех же условиях, что в примере 1. Результатыприведены в табл.З. Таким образом, для культивирования целесообразно использовать почки разме ром не менее 3 мм. П р и м е р 3. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в но ябре, феврале с 20-летних деревьев (20 клонов). Культуры почек выращивают на среде 1 с различными концентрациями гормональных веществ. В ходе экспериментов установлены предельные значения иоптимальные концентрации БАП и кинетина, Результаты представлены в табл.4 и 5 соответственно.П р и м е р 4. Растительный материал, как в примере 1. После культивирования на средах 1 и 2 полученные множественные микропобеги отделяют и субкультивируютиндивидуально на среде 3 с различными концентрациями мочевины с целью удлинения. Экспериментально определены предельные значения и оптимальныеконцентрации мочевины. Результаты представлены ниже.Концентрация мо- Средняя длина чевины,мг/л побегов,мм20 6,1 30 8,4 50 5,7П р и м е р 5. Черенки длиной 10 см заготавливают путем отстрела в 100-летних естественных насаждениях лиственницы Сукачева, принадлежащих к двум популяциям (20 клонов). Через 5 дней после сбора апикальные почки диаметром 3-4 мм вводят в культуру (после удаления покровных че1571064 шуй) и выращивают последовательно на питательных средах 1-3 с оптимальными концентрациями добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, мочевина 30,0 мг/л, Культуры помещают в термосветоклиматокамеру при тех же условиях, что в примере 1, но освещенность поддерживают на уровне 25000 лк, Эффективность образования дисков варьирует между клонами и составляет в среднем 55 , число формирующихся побегов изменяется от 13 до 14, а в среднем 8,3, средняя длина побегов к концу удлинения 6,2 мм, Продолжительность процесса мультипликации 16-18 недель,Преимуществами изобретения являются: возможность микроклонирования взрослых элитных деревьев лиственницы (до 100 лет включительно), относящейся к числу наиболее ценных трудноразмножаемых хвойных пород; идентичность растений-регенерантов и донорского дерева по генотипу вследствие мультипликации, через пазушное побегообразование; высокая степень мультипликации(до 25 побегов на эксплантат), ранее достигаемая только на лиственных древесных породах; эффективное удлинение побегов (до 6-10 мм); п ростота подготовки и хранения растительного материала перед введением в культуру (отсутствие гормональной и прочей обработки); быстрота процесса, занимающего от момента введения эксплантатов в культуру до получения удлиненных побегов 85-130 дней; возможность круглогодичного проведения работ,5 Формула изобретенияСпособ микроклонального размножения лиственницы, включающий посадку эксплантатов на питательную среду,10 культивирование, получение регенерантови адаптацию их к условиям открытого грунта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюувеличения выхода размножаемых растений и ускорения процесса размножения, в15 качестве эксплантатов используют покоящиеся апикальные почки диаметром 3 мм иболее, а культивирование осуществляют втри этапа. при этом на первом этапе - инициации морфогенеза пазушных почек -20 культивирование ведут на среде Литвей, вкоторую вводят дополнительно 6-бензиламинопурин в количестве 0,5-1,5 мг/л, и кинетин, в количестве 0,5/2,0 мг/л; на второмэтапе - формирование пазушных побегов -25 культивирование ведут на среде Соммерабез фитогормонов, на третьем этапе - удлинение побегов - культивирование ведут насреде Соммера с уменьшенным вдвое количеством минеральных солей, в которую до 30 полнительно вносят мочевину в количестве20-50 мг/л,Таблица 1 Состав среды 1 ( по Литвей ) 2 (по Соммеру), моди 3 (по Соммеру), моди- и и ованная и и ованная 1650,0 1900,0 1850,0 340,0 22,0 7,837,34,1531,021,043,000,501,250,13100,020000,00,50,10,1 ч Н 4 ЙОзКМОзМд 304 7 Н 20КН 2 РО 4 .СаС 1 г 2 Н 20( Й Н 4)2504КСЧаНР 04 НгОГеЯО 4 7 НгОЧа 2 ЕДТА 2 Н 20КНЗВОзМпЯО 4 Н 20ЕпЯ 04 7 Н 20Са 504 5 Н 20Йа 2 Мо 04 2 Н 20Со С 2 6 Н 20МезоинозитСахарозаНикотиновая кислотаПиридоксин - НСТиамин - НС Соде жание в с е е, мг/л 1000,0 250,0 150,0 200,0 300,0 180,0 27,8 37,3 0,75 3,0 10,0 3,0 0,25 0,25 0,25 10,0 20000,00,1 0,1 1,0 500,0 125,0 75,0 100,0 150,0 90,0 13,918,65 0,371.5 5,0.1,50,12 0,12 0,12 10,0 20000,00,1 0,1 1,01571064 рН 5,6 - 5,Таблица 2 женное в %,Таблица аблица еч льтуру эксплантато е: Конце 1 мг/лПродолжение табл,1 олжение табл.2 ия кинетина во всех вариантаПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1487 Тираж 486 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5