Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым вредителям

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) (11) Е ЫХ 1 МОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И. ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗС)БР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Ленинградский государственный университет(54) СПОСОБ ОТБОРА РАСТИТЕЛЬНФОРМ, УСТОЙЧИВЫХ К НАСЕКОМЬВРЕДИТЕЛЯМ Изоб етение относится к сельском хор У зяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых. к насекомым-вредителям, при селекции.Известны способы селекции растений, обладающих устойчивостью к насекомцмвредителям, обусловленной измененным составом фитостеринов, которые основаны нэ использовании суспенэионнцх культур 1 п чтго. Селекция заключается в отборе на уровне единичных клеток, что сопровождается низкой выживаемостью растительных клеток, в том числе и мутантных, и приводит к резкому снижению вероятности отбора клеток с нужными свойствами.Известен способ селекции растений при. получении клеточных линий табака, имеющих измененный количественный состав фитостеринов. В известном способе в(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, при селекции. Целью изобретения является увеличение выхода устойчивых растительных форм и упрощение способа. Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, предусматривает культивирование микрокаллусов на среде, содержащей нэ ниже сублетальной дозы нистатина, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерэнтов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях. При этом жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с мощностью светового потока 2 Дж/м с экспозицией 4-6 мин. 1 з.п. ф-лы, 4 табл. качестве селективного агента среды приме нены полиеновые антибиотики нистанин и амфотерицин В, Клеточные линии получают с использованием суспензионных культур.Недостатком известного способа является большая потеря мутантов в силу специфики роста растительных клеток 1 п ч 1 го, а также возможная утрата ими морфогенетических потенций, что исключает получение растений-регенерантов. Это приводит к длительным срокам селекции с нужными свойствами устойчивости,Целью изобретения является увеличение количества мутантных клеточных линий, сохраняющих способность к морфогенезу, и скорости их получения.Поставленная цель достигается тем, что в известном способе отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, 1717016сиге - Скуга (4), также содержащей фитогормоны (6-бензиламинопурин (БАП) 2,5 мг/л и а-нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л).Для получения устойчивых к нистатину кле точных линий в среду для культивированияпосле автоклавирования добавляют нистатин в концентрации сублетальной, величина которой установлена экспериментально.Так, для табака она составляет 50 мг/л, а для 10 гороха - 60 мг/л, и эти сублетальные концентрации не полностью подавляют рост растений, Культивирование проводят в чашках Петри. в каждую помещают по 22 микрокаллуса. За единицу варьирования при 15 анализе берут один микрокаллус, контролем служат микрокаллусы, растущие на среде без нистатина. Антибиотик нистатин, вносимый в питательную среду, растворяют в диметилсульфоксиде, а для контроля при меняют среду с диметилсульфоксидом(ДМЯО). Чашки Петри с каллусами помещают в термокомнату при 22 - 26 С в темноту.Результаты культивирования оценива ют на 10 - 16-й день роста каллусов, Определяют долю растущих каллусов по отношению к общему их числу, Сублетальной считается такая доза, при которой процент растущих микрокаллусов не 30 превышает 2 О. Первичные каллусы пассируются на среду того же состава и каждое последующее культивирование осуществляют через 15-20 дней. Для увеличения количества устойчивых к нистатину 35 микрокаллусов растений используют ультрафиолетовое (УФ) облучение в экспозиции 4-5 мин, причем облучение проводятлампами с мощностью светового потока 2 Дж/м в среде устанавливают не ниже сублетальной дозы для данной культуры.Цель достигается также тем, что жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом смощностью светового потока 2 Дж/м с экспозицией 4-6 мин.Сущность предлагаемого изобретениязаключается в следующем. Каллусная ткань,полученная 1 п чтго из частей проростков, понабору запасных веществ, составу фитостеринов и другим свойствам соответствует целому растению и в качестве единственногоисточника питания может обеспечить нормальное развитие насекомого. Используяметоды клеточной селекции, можно получить клеточные линии с измененным составом стеринов, а из них - растениярегенеранты, которые и будут влиять на развитие насекомых-вредителей посредствомнеполного удовлетворения пищевых потребностей насекомых.В предлагаемом способе мутанты получают с использованием микрокаллусов,Микрокаллусы - небольшие кусочки каллусной ткани размером 1,5 - 2 мм, светлые, рыхлые, легко диспергируемые. Микрокаллусхарактеризуется высокой скоростью роста ипервичную устойчивость растения можнооценить на 10-15-й день с момента посадкирастительной ткани, тогда как при использовании суспензионной культуры этот сроксоответствует 30-40 дням, Применение нистатина в питательной среде в дозах, нениже сублетальных, которые частично ингибируют рост микрокаллусов, обеспечиваетселекцию первично-устойчивых каллусов,дающих мутантные клеточные линии, сохраняющие нужный признак - устойчивостьк насекомым-вредителям и на неселективных средах в дальнейшем,Способ осуществляют следующим образом,В качестве растительного материала используют каллусную культуру, полученнуюиз асептических проростков культуры на 55среде для каллусообразования, например,ВММО (3), содержащий фитогормоны (2,4 дихлорфеноксиуксусная (2,4 - Д) кислота0,1 мг/л, кинетин 0,04 мг/л,В-индолилуксусная кислота (ИУК) 3 мг), или на среде Мура 40 45 50 предусматривающим культивирование растительных клеток на среде, содержащей нистатин, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях, в соответствии с предлагаемым изобретением, в качестве культуры растительных клеток используют культуру микрокаллусов растений, а содержание нистатина с на расстоянии 0,7 м над поверхностью чаши. Селекцию клеточных штаммов на устойчивость к нистатину проводят следующим образом. На среде с нистатином растут только единичные микрокаллусы, первичноустойчивые. Для уменьшения гетерогенности клеточной популяции. проводят субселекцию, Для этого из отобранного клеточного штамма, индивидуально от каждого, берут микрокаллусы и снова помещают на среду с нистатином в той же концентрации, грассирование повторяют 2-3 раза, что приводит к уменьшению числа устойчивых штаммов, как правило, в 2-3 раза, Мутантная природа полученных штаммов изменений доказывается сохранением признака в неселективных условиях. Проверка этого критерия осуществляется отбором микрокаллусов от каждого устойчивого штамма и пассивированием его на среде беэ нистатина, причем пассирование проводят дважтывают и соотносят с числом 5первичноустойчивых штаммов, Параллель 10 20 признака на среде с нистатином;В ходе осуществления способа необходим выбор сублетальной концентрации ни диапазоне 0,1-50 мг/л, причем нистатин,взятый в концентраЦии даже 0,1 мг/л, подавляет рост микрокаллусов и по мере увегороха на устойчивость с применением нистатина с активностью 5200 ед/мг. В среду, содержащую нистатин концентрацией 50 40 мг/л, в чашках Петри вносят 311 каллусов гороха линии 1-23/2, помещают чашки Петри на термостатирование при 22-26 С в темноте. После культивирования в течение15 дней отбирают первичноустойчивые каллусы, способные к морфогенезу, и опредеды,а затем опять переносят на среду с нистатином. Выросшие штаммы на среде с нистатином относят к устойчивым клеточным линиям, Число таких штаммов подсчино ставят контрольный опыт - получение каллусов на среде без нистатина,. Чашки с каллуса контрольных и устойчивых штаммов на среде МЗ, содержащей 6-бензиламинопурин (ВАР) в концентрации 1 мг/л, помещают на досветку и на 30-й день наблюдают появление растений-регенерантов, Для укоренения каждый побег отделяют от общей массы и переносят на среду,МЯ без фитогормонов, Для проверки сохранности признака у растения проводят морфогенетический цикл растение - регенерант - каллус, Для этого от каждого растения получают вторичный каллус и в соответствии с изложенной выше методикой с помощью микрокаллусов проверяют сохранность статина, ингибирующей рост микрокаллусов, При определении такой дозы используют концентрации нистатина в личения, концентрации антибиотика процент растущих микрокаллусов резко снижается (табл.).П р и м е р 1, Испытывают влияние различных концентраций нистатина на рост микрокаллусов табака. Выявлено, что ингибирующая рост концентрация нистатина 60 мг/л, а сублетальная - 50 мг/лдля нистатина с активностью 5200 ед/мг, при этом сублетальной концентрации соответствует около 2 растущих микрокаллусов после селекции(табл. 1), При активности нистатина 3200 ед/мг снижение растущих каллусов до 2 , отмечалось при концентрации антибиотика 15 мг/л (табл. 1) П р и м е р 2. Испытывают культуру ляют процентное отношение их к исходному количеству образцов. Для данной концентрации нистатина их количество равно 49,8 (по пяти опытам 32,4-54,3). 35 40 П р и м е р 3. Испытывают культуругороха 1-23/2 аналогично примеру 2, приконцентрации нистатина 50 мг/л. Отобрано20,4, растущих каллусов (по пяти опытам18,3-24,2 ).П р и м е р 4. Испытывают культуругороха 1 - 23/2, аналогично примеру 2, с нистатином активностью 5200 ед/мг, концентрацией 60 мг/л. Берут 297 микрокаллусов,после культивирования отобрано 1,2 растущих каллусов (по пяти опытам 0,9-1,5).П р и м е р 5. Испытывают культуругороха, аналогично примеру 2, с нистатиномконцентрацией 70 мг/л. Берут 326.микрокаллусов для культивирования, после 15.дней жизнеспособных каллусов не обнаружено (по пяти опытам 0,00-0,08 О).П р.и м е р 6. Испытывают культуругороха 1 - 23/2 на среде с ДМЯО, без нистатина, аналогично примеру 2; Берут исходно174 микрокаллуса, после культивирования(через 15 дней) обнаружено 98,0 О растущих .микрокаллусов (по пяти опытам 96,8 - 99,8 О),П р и м е р 7. Испытывают культуругороха в контроле на среде без добавок аналогично примеру 2. Берут 230 микрокаллусов, и через 15 дней обнаружено растущихмикрокаллусов 90 О (по пяти опытам 85.4 -91,3%).По примеру 2 - 7 делают вывод о влияниинистатинэ на развитие микрокаллусов и устанавливают сублетальную дозу 60 мг/л приактивности 5200 ед/мг, ингибируащую - 70мг/л. Результаты сведены в табл, 2,П р и м е р 8. Испытывают влияниеУФ-облучения в присутствии сублетальныхконцентраций нистатина на развитие растений и увеличение количества мутантных клеток табака. Микрокаллусы облучаютУФ-светом в течение 2-6 мин, При субселекции первичноустойчивых каллусов, отобранных по схеме примера 2, после2-кратного пассирования на среде, содержащей нистатин, отбирают устойчивые линии, сохранившие признак в неселективныхусловиях.Берут исходных микрокаллусов 231,культивируют на среде с содержанием нистатина активностью 5200 ед/мг 50 мг/л,облучают растения УФ-светом в течение 2мин. После селекции отбирают 2 первичноустойчивых каллуса, производят субселекцию, после которой устойчивых каллусов несохранилось.П р и м е р 9. Испытывают влияниеУФ-облучения на развитие растений иувеличение клеточных линий табака, аналогично примеру 8, с облучением УФ-светом втечение 3 мин. Из исходных микрокаллусовпосле культивирования отобрано первично 1.717016устойчивых 3, устойчивых после субселекции каллусов не выявлено,П р и м е р 10. Испытывают влияние УФ-облучения на табак, аналогично примеру 8, с облучением его в течение 4 мин, Из 231 исходного микрокаллуса после культивирования выявлено первичноустойчивых 9, устойчивых после.субселекции 3 и устойчивых после проверки в неселективных условиях 3.П р и м е р 11. Испытывают влияние УФ-света на табак, аналогично примеру 8, с облучением в течение 5 мин. Из 320 исходных микрокаллусов отобрано первично- устойчивых 2, однако после субселекции устойчивых образцов не выявлено,П р и м е р 12, Испытывают влияние УФ-облучения на табак аналогично примеру 8, с облучением в течение б мин, Из 231 исходного микрокаллуса отобрано первичноустойчивых 4, после субселекции устойчивых 2, и устойчивых после проверки в неселективных условиях 2,П р и м е р 13. Проводят опыт аналогично примеру 8 без УФ-облучения, Из 326 исходных микрокаллусов отобрано первично- устойчивых 2, а после субселекции устойчивых образцов не обнаружено.По результатам примеров 8-13 делают вывод о влиянии УФ-облучения при мощности светового потока 2 Дж/м с экспозицией 4 - б мин в сочетании с культивированием на среде, содержащей нистатин в сублетальной для растения дозе, на увеличение количества устойчивых к нистатину клеточных линий, выдержавших проверку на устойчивость в неселективных условиях,Результаты опытов с табаком и горохом приведены в табл. 3.П р и м е р 14. У устойчивых растений табака и исходной клеточной линии, на которой они были получены, методами газовожидкостной хроматографии проанализирован состав стеринов, Ориентировочный состав стеринов проверяемый у растений, следующий; холестерин (1), кампестерин (2) стигмастерин (3), ситостерин (4) и другие (5).Стерины испытанных растений в контроле распределились но позициям укаэанных стеринов следующим образом; 1 - 22, 2 - 21, 3 - 45, 4- 12, 5 - 0.Для растений-регенерантов (в контроле) соотношение стеринов: 1 - следы, 2 - 30 , 3 - 44 , 4 - 256, 5 - 0 ,Для нистатин-устойчивых клеточных линий: 1 - следы; 2 - 26, 3 - 210 , 4 - 58%, 5 - Оо Для каллусов (в контроле), 1 - 140 , 2 - 28, 3 - 22, 4 - 36 , 5 - 0%. Для нистатин-устойчивых растений-регенерантов: 1 - 17%, 2 - 17 , 3 - 530 , 4 -86, 5 - 00 .Таким образом, все устойчивые к ниста 5 тину клеточные линии и растения-регенеранты имеют измененный состав стериновпо сравнению с контрольными образцами.П р и м е р 15. У устойчивых растенийгороха и исходной клеточной линии метода 10 ми газово-жидкостной хроматографии проанализирован состав стеринов,Ориентировочный состав, проверяемый урастений, такой как в примере 14.По позициям, указанным выше, стери 15 ны испытанных растений распределилисьследующим образом;растения. (контроль): 1 - 210 , 2 - 10%, 3- 23%, 4 - 260 , 5 - 20 ;каллус (контроль): 1 - 70 , 2 - 9%, 3 -20 100 , 4 - 250 , 5 - 49%;нистатин-устойчивые клеточные линии,штамм 1; 1 - 80 , 2 - 00 , 3 - 00 , 4 - Оф,5 - 920штамм 2; 1 - 9%, 2 - 0%, 3 - 0%, 4 - 8,25 5 - 830 :штамм 3; 1 - 0, 2 - 0 70, 3 - О 70, 4 - 38,62 штамм 4: 1 - 80 ,2 - 150 , 3 - 110 4 -280 , 5 - 380 .ЗО Таким образом, все нистатин-устойчивые клеточные линии гороха имеют существенно иной состав фитостеринов посравнению с контролем.Результаты примеров 14 - 15 сведены в35 табл,4.П р и м е р 16. Оценивают устойчивостьполученных линий табака в системе растение-дрозофила (разработанная авторамиэколого-генетическая система для тестиро 40 вания растительных объектов). Устойчивость растений к насекомым-вредителямоценивают по плодовитости дрозофилы, длякоторой исследуемое растение (в виде микрокаллуса) является пищевым субстратом.45 Достоверное снижение плодовитости дрозофилы служит доказательством устойчивости растения к насекомому-вредителю,поскольку жизнеспособность его зависит отсодержания стеринов и их нормального со 50 отношения в данном растении.Для табака (каллусы в контроле) плодовитость мух составляет 38,0%, При содержании мух на мутантных клеточных линиях,нистатин-устойчивых, плодовитость состав 55 ляет 6,2 и 8.4%, что говорит о достоверномснижении плодовитости мух на нистатин-устойчивых линиях,П р и м е р 17. Оценивают устойчивостьклеточных линий гороха в системе растениедрозофила аналогично примеру 16. Плодо10 1717016 Таблица 1 Влияние концентрации нистатина на рост микрокаллусов табакагВариант опыта Количество микро- Растущие никрокаллусыкаллусов и доверительный интерваль 98,3 96,2 - 996 90,0 84,0 - 94,7231 252 252 60 мг/л 252 витость дрозофилы на контрольном штамме составляет 49,0 ое а на устойчивой клеточной линии - 13,6, при этом наблюдается задержка в развитии и нарушение репродуктивной системы самок мух, 5 Таким образом, среди устойчивых к нистатину линий растений (например, табак, горох) есть такие, которые в целом и обеспечивают развитие дрозофилы, но с задерж- .10 кой, и снижают ее плодовитость, Изменение метаболизма фитостеринов в растении позволяет блокировать развитие насекомого.Технико-экономическая эффективность прелагаемого изобретения по сравнению с 15 известным заключается в существенном ускорении и направленном отборе растительных форм, устойчивых к насекомым-, вредителям, за счет получения многочисленных растений-регенерантов на основе 20 отобранных устойчивых клеточных линий с использованием системы микрокаллусов. Современная селекция растений, устойчивы к насекомым-вредителям, предусматривает получение, прежде всего, набора 25 растительных форм, подлежащих испытанию, из которых и выбирают устойчивые, причем результаты испытаний зависят от факторов внешней среды в гораздо большей степени, чем предлагаемый способ.Для культур с длительным циклом развития предлагаемый способ представляется наиболее эффективным, и существенно снижающим затраты на проведение селекционной работы для всех культур,Формула изобретения 1, Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, предусматривающий культивирование растительных клеток на среде, содержащей нистатин, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода устойчивых растительных форм и упрощения способа, в качестве растительных клеток используют микрокаллусы растений, а содержание нистатина в среде устанавливают не ниже сублетал ьной дозы.2. Способ по п.1, отл ич а ю щи йс я тем, что, с целью повышения выхода устойчивых растительных форм, жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с помощью светового потока 2 Дж/м с экспозицией 4-6 минг12 1717016 Таблица 2Влияние изменения концентрации нистатина нарост микрокаллусов гороха (1-23/2) Количество растущих иикрокаллусови доверительныйинтервал, Ф Количество микро" каллусов Вариант опыта 90,0 854 - 913 98,0 96,8 - 99,8230 Контроль 174 0 МБО 311 40 мг/л 283 50 мг/л 60 мг/л 32670 мг/л ттеееееее. Та бли ца 3 Влияние Уфтоблучения на получение устойчивых к нистатину клеточных линий табака и горохаГорох Табак Иикрокаллусы еее е е е е е е т е т Е е аааДоза Уфтоблучения за время, Доза Уфтоблучения за время,мин мин ее 0 3 4 6 0 2 3 4 5 6 283 360 0 3 740 326 231 210 231 320 231 5 2 2 3 9 2 4 Исходные Первичноустойчивые 6 Устойчивые послесубселекции З о о о З 0 2 Устойчивые послепроверки в неселективных условиях а3 0 0 0 3 0 2 0 Нистатин с активностью 5200 ед/мг 49,8 32,4 - 54,3 20,4 18,3 - 24)2 1,2 0,9 - 1,5 0,0 о,оо - о,о 8Табак Растение (контроль) 22 30 Следы Каллус (контроль) 28 14 22 Следы 17 Горох Растение (контроль) 26 20 21 10 49 10 7 линии: б 2 Ш8 15 11 28 П р и м е ч а н и е. + - относительное время удержания стеринов по холестерину. Редактор Э.Слиган Заказ 822 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101 Растение-регенерант (кон"троль) Нистатин-устойчивая клеточнаялиния Нистатин-устойчивые растениярегенеранты Каллус (контроль)Нистатин-устойчивые клеточные штамм 1 штамм 2 штамм 3 штамм 4 Составитель Н.КузенковаТехред М.Моргентал Корректор Т.Палий