Анализатор микрообъектов в протоке жидкости и способ его настройки

(19) (1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР ИТЕТКРЫТИЯМ ЕНИЯ Е ИЗОБРДЕТЕЛ ЬСТВУ САН АВТО РСКО О 7(71) Институт биологической физики АНСССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1056008, кл. 6 01 К 21/64, 1983.Ятееп Н.В, 31(потапеоцз ЯерагасеОетестог о 1 Еоа Ап 9 е апб магде Ап 91 е ОцйЯсаттегпц 1 и ап Агс Е.авр Вазед РоаСутогпесег, Сутотетгу, ч.7., М 5, 1986, 445449.(54) АНАЛИЗАТОР МИКРООБЪЕКТОВ В ПРОТОКЕ ЖИДКОСТИ И СПОСОБ ЕГО НАСТРОЙКИИ(57) Изобретение относится к биофизическому приборостроению, позволяет реализовать статистический анализ клеточных популяций методом проточной цитометрии и может быть использовано в биологии, биотехнологии, медицине. Цель изобретения - расширение класса исследуемых объектов. Для этого от каждого микрообъекта в зоне измерения протока суспензии регистрируют сигналы флюоресценции в обратном ходе лучей через высокоапертурный линзовый микрообъектив 6 с центральным экраниро1716401 ванием 7 и сигналы светорассеяния по направлению темно-польного освещения. Сначала с помощью первой оптической системы 1 формируют зону измерения на вертикально расположенном стекле 16 внутри камеры 13, которую затем вакуумируют, обеспечивая подачу суспензии через канал 25 из сосуда 26 открытого типа и буферной жидкости через сопло 21 гидродинамической фокусировки, соединенное с емкостью 24 шлангом 23. С помощью участка 35 сбора жидкости, расположенного в камере 13, а также последовательно установленных на шланге 23 устройства 29 регулировки подачи жидкости и промежуточной емкости 30 со средствами установки уровня 31, 32 и его автоматического поддержания 33, 34 обесИзобретение относится к технической физике и биофизическому приборостроению, направлено на создание метода проточной цитометрии для решения научных проблем и прикладных задач в различных областях биологии, биотехнологии, медицины, в частности, может быть использовано при ранней диагностике заболеваний, скрининге различных веществ, изучении клеточной пролиферации и действия на организм различных физико-химических факторов,Известен анализатор микрообъектов в протоке жидкости, содержащий оптическую систему освещения и сбора потока флюоресценции микрообъектов с полевой диафрагмой и высокоапертурным линзовым микрообъективом, а также систему переноса суспензии микрообъектов, выполненную в виде камеры с горизонтальным прозрачным стеклом, в которой имеются сопло гидродинамической фокусировки, установленное в вертикальном или горизонтальном направлениях или под углом к оптической оси и соединенное шлангом с емкостью буферной жидкости, и канал подачи суспензии микрообъектов, установленный по центру сопла гидродинамической фокусировки и связанный с сосудом для суспензии микрообъектов.Известен способ управления этими анализаторами, заключающийся в формировании зоны измерения при освещении через высокоапертурный линзовый микрообъектив, формировании протока суспензии в зоне измерения при его гидродинамической фокусировке с помощью буферной жидкости с последующей регистрацией сигналов флюоресценции микрообъектов в обратном ходе лучей через микрообъектив. печивают ламинарность протока суспензии и оптимальные параметры его сечения в зоне измерения, протяженность которой и ее ориентацию относительно протока регулируют для управления длительностью сигналов от микрообъектов. Сигналы светорассеяния формируют по моноволоконному световоду 10 от второй оптической системы 8 с непрозрачным экраном 9. При этом минимизацию фонового рассеяния и управление минимальным и максимальным углами светорассеяния обеспечивают с помощью защитного элемента 19 внутри камеры 13, установки оптимальных размеров кольцевой апертурной диафрагмы системы 8 и формирования изображения зоны измерения на входном торце световода 10, 2 с.п, ф-лы, 1 ил. Недостатками известных анализаторовмикрообъектов в протоке жидкости и, соответственно, способов их управления являются, во-первых, отсутствие возможности5 контроля за размером каждого исследуемого микрообъекта, например с помощью регистрации сигналов светорассеяния вмалых углах, во-вторых, отсутствует возможность ориентации зоны измерения от 10 носительно протока суспензии и нереализованы перестраиваемые режимыгидродинамической фокусировки протокасуспензии, что позволило бы оптимальноустанавливать такие параметры, как протя 15 женность зоны измерения и размеры сечения протока в ней.Наиболее близким к изобретению является анализатор микрообъектов в протокежидкости, содержащий первую оптическую20 систему темно-польного освещения и сборапотока флюоресценции микрообъектов с полевой диафрагмой и высокоапертурнымлинзовым микрообъективом с центральнымэкранированием, вторую оптическую систе 25 му сбора потоков рассеянного вперед микрообъектами света, а также системупереноса суспензии микрообъектов на прозрачное стекло с каналом подачи суспензии,связанным с сосудом для суспензии микро 30 объектов и установленным по центру соплагидродинамической фокусировки, котороесоединено шлангом с емкостью буфернойжидкости,Способ управления данного анализато 35 ра заключается в формировании зоны измерения при темно-польном освещении путемцентрального экранирования высокоапертурного линзового микрообъектива, формировании протока суспензии в зонеизмерения при его гидродинамической фокусировке с помощью буферной жидкости, минимизации уровня фонового рассеянного излучения с последующей регистрацией сигналов флюоресценции микрообъектов в обратном ходе лучей через микрообъектив и регистрации сигналов рассеянного вперед микрообъектами света через оптическую систему.Основными недостатками указанного анализатора и способа его управления являются: сложность системы переноса жидкостей, требующей специальные устройства для формирования под давлением протоков как суспензии, так и буферной жидкости, при этом возникает сложность точной установки разности давлений на подачу этих жидкостей для обеспечения постоянства скорости прохождения микрообъектов относительно зоны измерения, ламинарного протока и регулировки размеров сечения протока суспензии в зоне измерения, т.е. всех тех параметров, выполнение которых крайне необходимо для максимального разрешения системы и обеспечения минимального коэффициента вариации пиков на гистограммах распределений исследуемых микрообъектов; отсутствие возможности ориентации зоны измерения относительно протока суспензии и сложность системы для регистрации сигналов рассеянного вперед микрообъектами света в результате использования двухступенчатого формирования изображений зоны измерения, что обусловило наличие большого количества оптических элементов и второго регистрирующего датчика света; отсутствие свободного доступа к суспензии в процессе эксперимента; возможность осаждения микрообъектов в суспензии в процессе измерения при ее подаче под давлением.Указанные недостатки обусловлены тем, что система переноса жидкостей выполнена закрытого типа под давлением, а зона измерения расположена в свободном пространстве между микрообъективом и прозрачным стеклом, на наружную поверхность которого наносится проток суспензии. Кроме того, в известном анализаторе не предусмотрено поворота полевой диафрагмы вокруг оптической оси, а также для сбора потоков светорассеяния реализована оптическая система с фотоэлектронным умножителем на основе телескопа, настроенного на изображение в бесконечности.Цель изобретения - расширение класса исследуемых объектов и упрощение анализатора.На чертеже изображена схема предложенного анализатора. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Анализатор микрообъектов в протоке жидкости содержит первую оптическую систему 1 для темно-польного освещения и сбора потока флюоресценции микрообъектов, которая имеет полевую диафрагму 2 со средствами ее перемещения 3 и поворота 4, светоделительную пластинку 5 и высоко- апертурный линзовый микрообъектив 6 с центральным экранированием 7. Для сбора потоков рассеянного вперед микрообъектами света в анализатор введены вторая оптическая система 8 с непрозрачным экраном 9 и моноволоконный световод 10 со средствами светозащиты 11 и перемещения 12. Анализатор также содержит камеру 13 системы переноса суспензии микрообъектов с вертикальными передней 14 и задней 15 стенками, имеющими два отверстия, которые расположены напротив друг друга вдоль оси первой 1 и второй 8 оптических систем. Отверстие передней стенки 14 закрыто прозрачным стеклом 16, а в отверстии задней стенки 15 с помощью средств 17 установки размещена вторая оптическая система 8 перпендикулярно прозрачному стеклу 16, которая также имеет средства 18 перемещения и защитный конусный элемент 19 с отверстием 20 для слива жидкости, В верхней части камеры 13 установлено сопла 21 гидродинамической фокусировки с воздухосборником 22 в верхней зоне, которое соединено шлангом 23 с емкостью 24 буферной жидкости. По центру сопла 21 установлен канал 25 подачи суспензии, связанный с сосудом для суспензии микрообъектов 26, который снабжен мешалкой 27 и выполнен открытого типа для осуществления в него в процессе эксперимента добавок, например, с помощью шприца 28 ручного типа. На шланге 23 установлены последовательно ус-. тройство 29 регулировки подачи буферной жидкости и промежуточная емкость 30 со средствами установки уровня жидкости штуцеров 31, 32 и его автоматического поддержания 33, 34, Средства установки уровня жидкости выполнены, например, в виде регулируемой по высоте подставки 31 и выдвижного штуцера 32, а средства автоматического поддержания уровня жидкости выполнены, например, в виде поплавка 33, перемещаемого уровнем жидкости вдоль штуцера 32 и перекрываемого, таким образом, своей площадкой 34 его входное отверстие. В нижней части камеры 13 выполнен участок 35 сбора жидкости, соединенный через выходной штуцер Зб с емкостью 37 сбора жидкости, которая находится под вакуумом.Работа анализатора микрообъектов в протоке жидкости согласно предложенному способу его настройки состоит из семи этапов.Первый этап, Формируют первой оптической системой 1 ограниченное поле зрения на поверхности прозрачного стекла 16, обращенной внутрь камеры 13. Для этого световой поток от осветителя проходит прямоугольную полевую диафрагму 2, отражается от светоделительной пластинки 5 и формирует в поле зрения с помощью высокоапертурного линзового микрообъектива 6 входной люк или зону измерения микрообьектов, которую предварительно располагают с помощью средств 4 поворота перпендикулярно направлению предполагаемого протока жидкости из сопла 21. При этом наблюдают за расположением зоны измерения через микрообъектив 6 в обратном ходе лучей, прошедших пластинку 5 в направлении сбора потока флюоресценции или отраженного света.Второй этап. Осуществляют предварительное управление системой переноса суспензии микрообъектов. Для этого устанавливают промежуточную емкость 30 буферной жидкости с помощью подставки 31 таким образом, чтобы предполагаемый уровень был выше уровня в сосуде для суспензии микрообъектов 26. Над промежуточной емкостью 30 располагают емкость 24 буферной жидкости с возможностью перел иван ия ее содержимого самотеком. П ри этом обеспечивают заполнение всей системы буферной жидкостью и осуществляют удаление воздушных пузырьков через воздухосборник 22. Затем соединяют канал 25 подачи суспензии с сосудом 26 для суспензии микрообъектов, в котором обеспечивают перемешивание с помощью мешалки 27 и осуществляют вакуумирование емкости 37 сбора жидкости, тем самым обеспечивая через выходной штуцер 36 разрежение внутри камеры 13. При этом из сопла 21 формируется проток буферной жидкости, который сжимает коаксиально расположенный внутри него проток суспензии, осуществляя эффект гидродинамической фокусировки, Проток суспензии распластывается по поверхности прозрачного стекла 16, проходит зону измерения и вместе с буферной жидкостью попадает на участок 35 их сбора, который расположен под минимально допустимым углом к прозрачному стеклу 16, обеспечивая при этом возможность свободного прохождения ламинарного протока жидкостей.Третий этап, Настраивают в зоне измерения оптимальные параметры сечения протока суспензии. Для этого поочередно выполняют следующие операции; управляют устройством 29 регулировки подачи буферной жидкости, корректируют установку 5 уровня в промежуточной емкости 30 с помощью выдвижного штуцера 32 и обеспечивают автоматическое поддержание установленного уровня с помощью перемещения поплавка 33 с площадкой 34, Данные 10 операции выполняют до обеспечения плавной регулировки параметров сечения протока суспензии при изменении подачи буферной жидкости во всем диапазоне управления устройством 29.15 Четвертый этап. Ориентируют зону измерения относительно протока суспензии, Для этого поворачивают полевую диафрагму 2 средствами 4 поворота, фиксируют ее или при перпендикулярном расположении 20 зоны измерения к протоку суспензии, илипод некоторым углом, управляя тем самым изменением длительности сигналов, регистрируемых от каждого микрообъекта. 25 Пятый этап, Зону измерения и микрообъектив 6 с центральным экранированием 7 устанавливают коаксиально относительно оптической оси. Для этого прекращают подачу протока суспензии и буферной жидко сти, осуществляют развакуумированиеемкости 37 сбора жидкости и обеспечивают в нее слив всей жидкости из камеры 13, Затем с помощью средств 3 перемещения перпендикулярно оптической оси устанав ливают полевую диафрагму 2 так, чтобы световой поток, формирующий ее изображение через микрообъектив 6, располагался коаксиально относительно затемненного светового конуса, образованного после зоны 40 измерения между крайними внутреннимилучами потока темно-польного освещения,Шестой этап. Обеспечивают управление анализатором, достигая при этом регистрации сигнала флюоресценции 45 оптимальной амплитуды, длительности иформы от каждого микрообъекта, поступающего с суспензией в зону измерения из сосуда 26 для суспензии микрообъектов по каналу 25, Для этого создают разрежение в 50 камере 13 за счет восстановления вакуумирования емкости 37 сбора жидкости и осуществляют подачу протока суспензии и буферной жидкости в зону измерения при ее визуализации, регулируя при этом расход 55 буферной жидкости с помощью устройства29 до оптимальных параметров сечения протока суспензии. Затем корректируют расположение протока суспензии за счет перемещения камеры 13 относительно зоныизмерения.Седьмой этап. Обеспечивают управление анализатором, достигая при этом регистрации требуемого сигнала от потоков рассеянного перед каждым микрообъектом света. Для этого устанавливают защитный конусный элемент 19 около зоны измерения на минимальном расстоянии от прозрачного стекла 16, обеспечивая свободное прохождение ламинарного протока суспензии и максимально возможное перекрытие лучей светового конуса темно-польного освещения без перекрытия потока светорассеяния от исследуемых микрообьектов. Затем вторую оптическую систему 8 с помощью средств 18 перемещения перемещают вначале перпендикулярно оси, устанавливая при этом непрозрачный экран 9 по центру темной зоны освещения, а потом перемещают вдоль оси, обеспечивая сбор потока рассеянного света при минимальном (или требуемом) угле а 1 . При этом, учитывая размеры сформированной кольцевой апертурной диафрагмы или их изменяя за счет корректировки светового диаметра второй оптической системы 8 и/или диаметра экрана 9, осуществляют предварительную операцию минимизации уровня фонового рассеянного излучения. Для этого вторую оптическую систему 8 устанавливают вдоль оси так, чтобы размер сформированного им изображения зоны измерения не превышал размера входного торца моно- волоконного световода 10. Окончательная операция минимизации включает установку световода 10 с помощью средств светозащиты 11 и перемещения 12 в плоскости формирования изображения зоны измерения в направлении приема потоков светорассеяния от второй оптической системы 8. Для регистрации сигналов светорассеяния, которые с большей степенью вероятности коррелируют с размером (объемом) исследуемых микрообъектов, осуществляют корректировку расположения вдоль оси второй оптической системы 8, моноволоконного световода 10 относительно зоны измерения и друг друга до оптимального соотношения интенсивностей потоков света при минимальных,и максимальныхуглах рассеяния, Это соотношение устанавливается в зависимости от типа исследуемых микрообъектов и их размеров.Использование предложенных анализатора микрообъектов в протоке жидкости и способа его настройки для статистического анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии показало, что упрощенная конструкция анализатора, созданная на основе вакуумирования зоны измерения10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 для подачи микрообъектов и использованияменьшего количества оптико-механических элементов, обеспечила удобство управления в процессе экспериментов и позволила расширить по сравнению с известным функциональные возможности, При этом обеспечена постоянная скорость ламинарного протока суспензии микрообъектов через зону измерения, увеличено отношение сигнал/шум при регистрации сигналов флюоресценции и светорассеяния, обеспечен широкий диапазон регулировки размера сечения протока суспензии в зоне измерения.и реализована возможность ориентации зоны измерения относительно направления протока суспензии, что увеличивает разрешение системы и уменьшает коэффициент вариации пиков по гистограмме распределений исследуемых микрообъектов до значения не более 1. Кроме того, обеспечены свободный доступ к исследуемой суспензии в процессе эксперимента, возможность пипетирования, перемешивания, т.е. реализованы преимущества, позволяющие получить статистически достоверные результаты при анализе минимальных объемов суспензий.Преимущества изобретения позволили создать метод проточной цитометрии при использовании специфичных флюоресцентных зондов и решить ряд медико-биологических задач на основе реализованной возможности количественной оценки. изменений в мембранах и геноме лимфоидных клеток и клеток, культивируемых при действии различных физико-химических факторов (глюкокортикоидов, ионизирующей радиации и др.).Формула изобретения 1. Анализатор микрообъектов в протоке жидкости, содержащий первую оптическую систему темно-польного освещения и сбора потока флюоресценции от микрообъектов с полевой диафрагмой и высокоапертурным линзовым микрообъективом с центральным экранированием, вторую оптическую систему сбора потоков рассеянного вперед микрообъектами света, а также систему переноса суспензии микрообъектов на прозрачное стекло с каналом подачи суспензии, связанным с сосудом для суспензии микро- объектов и установленным по центру сопла гидродинамической фокусировки, которое соединено шлангом с основной емкостью буферной жидкости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения класса исследуемых объектов путем обеспечения одновременной регистрации потоков флюоресценции микрообъектов и рассеянного вперед микрообъектами света, а такжеупрощения анализатора, он дополнительно содержит средства установки и перемещения второй оптической системы, непрозрачный центральный экран второй оптической системы, установленный с возможностью формирования кольцевой апертурной диафрагмы, моноволоконный световод со средствами светозащиты и перемещения, установленный для приема световых потоков от второй оптической системы с возможностью формирования на его входном торце изображения полевой диафрагмы, промежуточную емкость буферной жидкости со средствами установки уровня жидкости и его автоматического поддержания, устройство регулировки подачи буферной жидкости в сопло гидродинамической фокусировки и средства поворота полевой диафрагмы, выполненной прямоугольной формы, при этом система переноса суспензии микрообъектов выполнена в виде вакуумируемой камеры, внутренняя полость которой ограничена прозрачным стеклом, и снабжена средствами для установки второй оптической системы на оптическую ось, перпендикулярную прозрачному стеклу, причем внутри вакуумируемой камеры расположен защитный конусный элемент, выполненный с отверстием для слива жидкости, в вакуумируемой камере установлен с возможностью подачи суспензии под углом на поверхность прозрачного стекла канал подачи суспензии с соплом гидродинамической фокусировки, в верхней по отношению к выходному отверстию зоне которого установлен воздухосборник, а в противоположной соплу части камеры расположен участок сбора жидкости под углом к прозрачному стеклу, соединенный через выходной штуцер с находящейся под вакуумом емкостью сбора жидкости, защитный конусный элемент установлен с возможностью свободного прохождения протока суспензии по прозрачному стеклу, промежуточная емкость и устройство регулировки подачи буферной жидкости установлены последовательно между основной емкостью и соплом гидродинамической фокусировки, при этом средства установки уровня жидкости расположены с возможностью подачи буферной жидкости из основной емкости в промежуточную, в которой уровень жидкости выше уровня в сосуде суспензии микрообъектов, а сосуд суспензии микрообъектов выполнен открытым и снабжен мешалкой,2. Способ настройки анализатора микрообъектов в протоке жидкости, заключающийся в формировании зоны измерения при темно-польном освещении путем центрального экранирования высокоапертурного линзового микрообъектива, формировании протока суспензии в зоне измерения при его гидродинамической фокусировке с по мощью буферной жидкости, минимизацииуровня фонового рассеянного излучения с последующей регистрацией сигналов флюоресценц от микрообъектов в обратном ходе лучей через микрообъектив и 10 регистрации сигналов рассеянного впередмикрообъектами света через оптическую систему, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения класса исследуемых объектов путем обеспечения одновременной регист рации потоков флюоресценции микрообъектов и рассеянного вперед микрообъектами света, а также упрощения анализатора, осуществляют регулировку уровня буферной жидкости относительно уровня суспензии, 20 обеспечивают подачу жидкости и суспензиив зону измерения, находящуюся под вакуумом, обеспечивают автоматическое поддержание установленного уровня жидкости, регулируют подачу буферной жидкости до 25 установки в зоне измерения постояннойтраектории прохождения микрообъектов, затем ориентируют зону измерения относительно протока суспензии и буферной жидкости путем ее поворота 30 вокруг оптической оси, прекращают подачупротока суспензии и буферной жидкости и осуществляют развакуумирование зоны измерения, затем устанавливают коаксиально относительно оптической оси зону измере ния и микрообъектов с центральным экранированием, восстанавливают вакуумирование зоны измерения и подачу в нее протока суспензии и буферной жидкости и перемещают проток относительно зо ны измерения до регистрации сигналовфлюоресценции от микрообъектов с одинаковым количеством измеряемого вещества, совпадающих по амплитуде, длительности и форме, после чего осуществляют централь ноеэкранирование оптической системы,формируя в ней кольцевую апертурную диафрагму, расположенную внутри темной зоны освещения коаксиально микрообъективу, при этом минимизацию 50 уровня фонового рассеянного излученияосуществляют путем формирования изображения зоны измерения оптической системой на входном торце моноволоконного световода, осуществляют поочередное пе ремещение моноволоконного световода иоптической системы до регистрации сигнала от потоков рассеянного вперед микро- объектами света, который соответствует минимальному коэффициенту вариации измеряемых параметров микрообъектов при14 1716401 13 15 20 25 30 40 50 Составитель В.КалечицРедактор М.Келемеш Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец Заказ 608 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб.,4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 минимальном угле рассеяния и максимальной величине соотношения между интенсивностями потоков света при минимальных и максимальных углах рассеяния.