Способ иммунодиагностики инфекций

(5040 0 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л к неспецифиэдоровых лиц фическому и генам с по 7 лекса специфичес антител по фор 605070/284.06.83 ольного титр антите ескому антигону и у итры антител к спец еспециическому ант ныи медичетом и д уг,щ икого я титра Те /Т СрТ,/муле: Индек биологичесетодам иссле му сп титр антител к нееец- титр анму антигену у антигену у больного; тител к неспецифичес кольного; Ср Т е редний титр ану антигену у я к обласнно к иммуель - рание точностител к специфичес относит еимуществнфекций,и повыше средий доровых л ческому титр антител к неспе а ц. При знаиагностирую нтигену у здоровых ии индекса больше 4 е исследозаболеваяют у нос тическс начала н екцию ьно иммун эом. Предвари специфическ агностикум тигеном. В диагностикум следующим давать перек ически ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Пермский государстцинский институт(56) Справочник по микрким и вирусологическимдования. - М,: 1982. СПОСОБ ИМУНОЛИАГ 1 ОСТИКИ ИНФЕ ЦИ(57) .Изобретен ти медицины, и нодиагностике няя диагностик ти способа. Л ванне производ ния, допоЛнит Изобретение относится к иене, преимущественно к областидиагностики инекий. 11 ель изобретения - ранняя диагноика и повышение точности способа. Способ выполняют следующим обрательно подбирают в пару к ому диагностикуму дис неспецифическим анбор неспецифического а осуществляют по критериям. Он не должен рестных реакций со спедиагностикумом и при од-новременном исследовании 10-12 здоровых людей или больных контрольной группы выявлять титры антител, коррелирующие с титрами антител к специфическому антигену с величиной коэффициента корреляции выше 0,5. Прн воэможности выбора неспецифического диагностикума из ряда диагностикумов предпочтительнее такой, который в паре со специфическим диагностикумом выявляет титры антител с наибольшим ковфициентом корреляции и с соотношением их средних величин в группе, близким к 1:1.В группе здоровых людей и контрольных больных общим числом неменее 20-25 чел, устанавливают соотношение титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам с применением тех эритроцитарных диагностикумов,которые предполагается пос тоянно использовать в последующих диагностических исследованиях. По результатам определения составляют стандарты соотношения титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам, Для этого индивидуальные результаты определения титров антител группируют, объединяя в отдельные группы индивидуальные показатели с одинаковым значением титра антител к неспецифическому . антигену, Для каждой такой группы с одним значением титра антител к неспецифическому антигену вычисляют среднее значение соответствующих индивидуальных титров антител к специфическому антигену. Эти стандарты постоянно используют в Последующих диагностических исследованиях, При проведении диагнос тического исследования у больного определяют натуральние титри антител к специфическому и неспецифическому антигенам и вычисляют индекс специфического повышения титра по соотношению титров антител у больного и в соответствующем стандарте из контрольной группы с такой же величиной титра антител к неспецифическому антигену. Поскольку при этом титры антител к неспецифическому антигену одинаковы у больного и в соответс.твующем стандарте, индекс вычисляют путем простого деления титра специфических антител у больного на средний титр антител к специфическому антш ену г, соответствующем стандарте.Нео 5 хопимо иметь достаточно большой набор стандартов соотношения титров антител, соответствуюший вариациям индивидуальных значений титров антител к неспецифическому антигену у диагностируемых больных. При отсутствии соответствующего стандарта расчет индекса можно производить по стандарту титра антител к неспс пифическому антигену, смежному с тигром этих антител у диагноетируемого больного. При этом титры антител к лбовЮим антигенам в стандарте увеличивают или уменьшают вдвое для приведения в соответствие величин титрж антител к неспецифическому анти сну в стандарте и у больного. 11 споль 45 50 1015203540 зование стандартов соотношения титров антител позволяет получить диаг ностически значимий результат при величине индекса 4,0 или даже не-. сколько ниже этой величины.Возможно применение и упрощенного стандарта соотношения титров. Если в контрольной группе средние величины титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам различа.- ются не более чем в 4 раза, индекс специфического повышения титра антител рассчитывают по формуле, но вводят в нее величини соотношения титров в контрольной группе, округленные до целых величин. При этом в случае соотношения величин среднегрупповьх титров в контрольной группе 1:1 индекс вычисляют простым делением титра специфических антител у больного на. титр его антител к неспецифическему антигену.Если при диагностическом исследовании используют нестандартные и нестабильные эритроцитарные диагностикумы, то одновременно с больным определяют титры антител к специфическом гнеспецифическому антигенам у трех контрольных лиц, Рассчитываютс.редние титры антител у контрольных лиц, и индекс вычисляют по формуле. При разнице средних титров антител у контрольных лиц более чем враза при расчете индекса у больного с предельно низким значением титра антител к неспецифическому нтигену можно получить завышенную величину. Поэтому в зоне крайне низких значений титров антител к неспецифическому антигену у диагностируемих больных найденную величину индекса следует уменьшить вдвое,Способ можно применять также приисследовании парных" сывороток. Дляэтого в обеих сыворотках следует дополнительно определить титры антителк неспецифическому антигену и в формулу расчета ввести соотношение титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам в каждой сыворотке. Расчет индекса можно производить как по соотношению титров антител но второй сыворотке к первой,так и в обратном порядке. При исследованиипарных сывороток диагностически значимой считают величину индекса 4 и выше, 492280П р и м е р 1. Применяют способ при диагностике дизентерии.В контрольной группе из 12 взрос лых здоровых людей и 16 больных де 5 тей с воспалительными заболеваниями, не относящимися к острым кишечным инфекциям, получена сыворотка крови. Каждая проба сыворотки раститрована в макроварианте РПГА с разведения от 1 О 1:2 до 1:512 в соответствии с "Наставлением по применению диагностикумов эритроцитарньж иэ шигелл Зонне, Флекснер,и Ньюкестл". Определены титры антител с диагностикумами из шигелл 15 Зонне и Флекоснер. У здоровых людей средние титры антител к шигеллам Зонне 1:8 (пределы колебаний от 1:16 до 1-256), к шигеллам Флекснера 1:81 (пределы колебаний от 1:8 до 1-256), 20 У больных детей контрольной группы средний титр антител к шигеллам Воине 1:92 (пределы колебаний от 1.4 до 1:256) и к шигеллам флекснера 1: 71 (пределы колебаний от 1: 16 до 25 1:256). Коэффициент корреляции титров антител к-шигеллам Зонне и флекснера 0,76.На основании исследований контрольной группы пара эритроцитарных диаг- ЗО ностикумов является вполне подходящей для проведения диагностического исследования при дизентерии. Учитывая равенство средних титров антител к обоим антигенам, расчет индекса можно производить простым делением титров антител к обоим антигенам, У контрольных лиц величина индекса не выходит за пределы 4,0.По результатам обследования контрольной группы фО диагностический титр составляет 1:512. Особенность применения этой нары диагностикумов состоит в том, что здесь заранее не определяется, какой из них считать неспецифическим. 4 В Установление принадлежности заболевания к одному из двух видов дизентерии производят по превышению величины титра антител к одному из видов шигелл более чем в 4 раза по отноше- ВО нию к титру, определяемому к другому виду шигелл.При дизентерии Зонне в первые 3 дня заболевания возможно не специфическое повышение, а специфическое угашение титра антител с падением титра антител к этому антигену до О. В этом случае для уточнения вида дизентерии целесообразно провести с сывороткой крови больного дополнительное исследование титра антител с диагностикумов, заведомо гетерогенным по отношению к диагностикумам из шигелл Зонне и Флекснера.У двух больных, поступивших на 1-й и 2-й день заболевания с подозрением на дизентерию, взята кровь, получена сыворотка и в ней определены титры антител с эритроцитарными диагностикумами иэ шигелл Зонне и Флекснера. У одного больного титры составили соответственно О и 1:128 и у другого 1:2 и 1:64. Расчет индексов указал на наличие дизентерии у обоих больных. У первого больного была предложена дизентерия Зонне, а у второго - дизентерия Флекснера, что полностью совпало с полученными позднее данными бактериологического исследования, Заключение о наличииодизентерии Зонне было сделано на основании нулевого титра к этому антигену,что никогла не встречалось у больных заболеваниями недизентерийной этиологии. Дополнительное исследование у этого больного титра антител к риккетсиям Провачека подтвердило правильность такого заключения.При обследовании предлагаемым способом 115 больных с бактериологически подтвержденной дизентерией Зонне и Флекснера на 1-4-й дни заболевания получено ЗОХ диагностически значимых результатов, а известным способом - О. В период с 5-го по 10-й дни заболевания предлагаемым способом получено 937 положительньж диагностических результатов, а при оценке по величине диагностичес- кого титра 1:512 - 403. С 11-го по 23-й дни заболевания предлагаемым способом получено 1 ООЕ положительных результатов, а при оценке по диагностическому титру - 532. При обследовании 15 больных со сроками от начала заболевания от двух двух дней до двух месяцев с диагнозом дизентерия Флекснера, поставленным на основании данных эпидисследования, но беэ бактериологического подтверждения, предлагаемый способ дал положительный диагностический результат у всех больных, а диагностический титр антител установлен лишь у двух больных.П р и м е р 2, Применение способапри диагностике менингококковой инФекции,Для диагностического исследованияиспользованы жидкие эритроцитарные5менингококковые диагностикумы типовА.В ц С,Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастераи н качестве неспецифического сухой,антигенный эритроцитарный диагности;кум из шигелл Зонне ЛенинградскогоНИИ вакцин и сывороток,У 1 О здоровьи людей-доноров полу чена сыворотка крови. Сыворотки раститрованы с-ной нормальной кроличьей сывороткой с разведением от 1:2 до 1.256 с объемом ингредиентов по 0,025 мл. Из каждой сыворотки при готовлено 4 ряда таких разведений, н лунки каждого ряда внесено по 0,025 мл 1 -ной взвеси каждого из испытываемых диагцостикумон, В каждом планшете для титрования определен 25 титр антител только к одному антигену. Планшеты выдержаны н термостате 2 ч. Титр антител к шигеллам Зонне определен по системе четырех крестов, титр протиномецингококконых анти тел - по последнему разведению с реакцией не ниже чем ца 2 креста. Средние титры антител состанили к менингококкам типа А 1:3,0 (пределы колебаний от 1:2 до 1:8),к мецццго - коккам типа В 1:2,5 (пределы колебаний от 0 до 1:4), к менингококкам типа С 1:1,6 (пределы колебаний от 0 до 1:4),к шигеллам Зонне 1:24 (пределы колебаний от 1:4 до 1:64). Титры противомецингококконых антител всех типов коррелируют с титрами антител к н.игеллам Зонце с величиной коз:5 фициента корреляции в пределах 0,8-0,9, Набор диагцостикумов подходит для диагностического исследования. Учитывая большую разницу в величине средних титров противомецицгококковых и противодиэентерийцых антител, целесообразно проводить определение индекса по дифференцированным стандартам соотношения титров антител у контрольных лиц. С этой целью дополнительно проведено определение титров антител у 1 О здоровых детей и 11 больных детей из контрольной группы. По результатам исследования составлены стандарты соотцошециятитров антител. Показано, что предельная величинаиндекса в контрольной группе составляет 3,6, поэтому бесспорное диагностическое значение имеет даже величина индекса 4,0, По результатам исследования контрольной группы принятза диагностическии титр протиноменицгококконых антител 1:32.У больного,. поступившего н инфекционную больницу с подозрением на мецингококконую инфекцию, и день поступления произведено определение титровантител.Исследование, показало, что у больного диагностически значима вели цнаиндекса специфического поньшения титра к мецингококкам типа В,Величина индекса н 4 раза превосходит предельнуюконтрольную величину индекса в стандарте с титром антител к шигелламВоине 1:4. В то же время величина титра к этому антигену в 4 раза ниже диагностического титра,Воэможность применения способапри исследовании 1 парных сыворотокпоясняет следующий пример,Больной К 7 мес, поступил н больницу с подозрением на мецццгококковуюинфекцию. В день поступления в больницу у него была взята сыворотка крови и заморожена н холодильнике. Вторая порция сыворотки была полученачерез 2 недели. В обеих сывороткаходновременно определены титры антител,Расчет индекса ясно показывает,что н первой сыворотке относительно второй специфически повышен титрантител к менингококкам типа А. Возрастание в 4 раза титров антител кменингококкам В и С в динамике заболевания носит неспецифический характер, поскольку точно так же изменяется в динамике титр антител к шцгеллам Зонне.При однократном обследовании предлагаемым способом 135 детей с генерализованными и локализованными формами менингококковой инфекций сосроками заболевания от 1 до 5 днейположительный диагностический результат получен н 86,2 ., а при оценке подиагностическому титру - в 25 . исследований.При исследовании "парных" сывороток предлагаемый способ дал положительный диагностический результат у77,8 . больных, а при оценке нзнестпмп35 50 Применение способа при диагностике герпетической инфекции поясняет следующий пример.Больной К. Поступил в клинику глазных болезней с диагнозом кератит55 предположительно герпетической природы. В тот же день было проведе но исследование титров нтител у способом по критерию 4-кратного прироста титра результаты исследования были отрицательными.Л р и м е р Э, Применение способа при диагностике герпетической ин 5 фекции,Для проведения диагностического исследования изготовлен самодельный жидкий эритроцитарный диагностикум с использованием формалинизированных и обработанных танином эритроцитов барана. Наличие у препарата специфической активности было подтверждено исследованием с противо герпетической референс-сывороткой.У 14 здоровых людей доноров получена сыворотка крови. Из каждой пробы сыворотки сделано 2 ряда разведений.в планшетах для микропроб с ис 20 пользованием в качестве разводящей жидкости 17-ной нормальной кроличьей сыворотки с объемом ингредиентов по 0,025 мл, В лунки одного ряда добавлено по 0,025 мл 17-ной взвеси зритроцитарного диагностикума из вируса герпеса, в лунки другого - такой же объем 17.-ной взвеси диагностикума из шигелл Зонне, Планшеты помещены в термастат на 2 ч. Титры антис30 тел к вирусу герпеса оценены по последнему разведению сыворотки с реакцией не ниже чем на 3 креста, титры антител к шигеллам Зонне - по известной системе. Средние титры антител к вирусу герпеса 1:3,8 (предель колебаний от 0 до 1:8), к шигеллам Зонне - 1:10,7 (пределы колебаний от 1:2 до 1:32). Величина коэффициента корреляции 0,56.Индивидуальные вариации индекса соотношения титров40 антител в исследованной группе были в пределах О 7-28. Пара диагностикумов годится дляпроведенил диагностического исследования, однако, учитывая не 45 стандартность диагностикума из вирусагерпеса, для диагностического исследования следует применить вариант с одновременным исследованием титров антител у больного и трех доноров. больного и трех здоровых людей-доноров.Данные исследования указывают навысокий уровень специфической реакции к вирусу простого герпеса и беэусловно свидетельствуют о наличии герпетической инфекции, Правильность такого заключения подтверждена обнаружением методом флуоресцирующих антител антигена вируса простого герпесав соскобе из конъюнктивы,При обследовании предлагаемымспособом 20 больных с различными формами герпетического кератита одно"кратное исследование титров антителпри поступлении дало положительныйдиагностический результат у всех об-,следованных. Антиген вируса простогогерпеса в соскобе иэ конъюнктивы об"наружен у половины больных. При исследованиипарны" ыроток, полученных при поступлении и через 2 недели, предлагаемый способ дал положительный результат у всех больных, апо известному способу с учетом критерия 4-кратного прироста титра антител к вирусу герпеса во второй сыворотке - только у 257. больных.Таким образом, предлагаемый способ позволяет диагностировать инфекцию с первого дня заболевания, а поизвестному способу диагностическоеисследование начинают не ранее 5-6-годня заболевания. Особенно существен"ный выигрьпп во времени получается придиагностике вирусных инфекций, прикоторых достоверный результат получается только при исследовании "парных сывороток, полученных с разницейво времени в 2-3 недели. Предлагаемый способ дает возможность получениядостоверного диагностического результата при исследовании однократнополученной сыворотки, что соответственно сокращает сроки диагностики на2-3 недели.Следующее преимущество предлагаемого способа заключается в повьппенииточности диагностики. Это доказывается сравнительными данными об уровне титра антител, при котором можнодиагностировать инфекцию предлагаемым и известным способами. При дизентерии достоверное значение имееттитр антител 1;512, по предлагаемомуспособу можно обнаружить достоверное изменение специфических антителс титра 1:16, а в случае специфичес35 кого угашения титра антител даже лри нулевом его значении. При менингококковой инфекции предлагаемый способ позволяет получить диагностический результат при титре антител5 в 4-8 раэ ниже диагностического титра, Благодаря этому предлагаемый способ позволяет получить достоверных диагностических результатов в 31 О 3,5 раза больше, чем исследование известным способом с определением диагностического титра.Благодаря повышению точносТи предлагаемый способ позволяет исключить как ложноположительные р езультаты исследования в тех случаях, когда повышение титра антител до диагностического уровня имеет неспецифический характер. В частности, согласно"Наставлению по применению диагностикумов зритроцитарных из шигеллдиагностическим считается титр антител1:200. Антитела в таком титре обнаруживаются у 147 обследованных из 25 о контрольной группы здоровых и больных людей. Применение предлагаемого способа позволяет определить неспециический характер такого повышенного титра антител и квалифицироватьрезультаты исследования как ложно- диагностические,Предлагаемый способ повышает точность исследования парныхсывороток в связи с возможностью контроляспецифичности динамики титра антител. По суммарным результатам всехисследований "парных" сывороток лриинфекциях предлагаемый способ позволяет установить неслецифический характер 4-кратного повышения титраангитеп у 2/3 больных. У них выявленоаналогичное и большее повышение титра а .т тел к неспецифическому антигену. Вместе с тем учет динамики титров 45одновременно к специфическому и неспецифическому антигенам и вычисление индекса увеличивает число диагностических результатов при исследованиипарных" сывороток в среднем в504 раза в сравнении с их оценкой покритерию 4-кратного прироста титраантител к специфическому антигену.Повышение точности способа выражается также в возможности одинаково55эффективного использования диагностикумов с разным уровнем их специфической активности. В частности, лрисравнении эритроцитарных диагностикумов из шигелл Зонне и флекснера жидких МНИИЭМ им,Габричевского и сухихЛНИИЭМ им,Пастера установлено, чтотитры выявляемых ими антител в однихпробах сыворотки отличаются в среднем в 2 раза. Соответственно этому,при обследовании группы больных дизентерией с оценкой по единому официальному для обоих препаратов диагностическому титру антител 1:200 получена разница в числе диагностическихрезультатов в 2 раза. При исследовачии предлагаемым способом полученыабсолютно одинаковые диагностическиерезультаты . При сравнении эритроцитарных менингококковых диагностикумовМНИИЭМ им, Габрического и ЛНИИЭМим.Пастера в параллельных пробах содними сыворотками крови установлено,что первый препарат выявляет титры антител в среднем в 15 раз выше по величине,чем второй. Если лри исследованииобоими препаратами пользоваться единым диагностическим титром (1:40)Г 1:80), то у больных менингококковой инфекцией получаются кардинальноразличные результаты. Исследование попредлагаемому способу дает совпадениедиагностических результатов у 903 обследованных.Предлагаемый способ дает возможность введения нового критерия оценки специфической активности эритроцитарных антигенных диагностикумов непо величине титра антител, а по диапазону градаций выявляемых ими титров независимр от их абсолютнойвеличины. Критерием достаточной специфической активности препарата является определение у здоровых людей ибольных специфической инфекцией титров антител в диапазоне, содержащемне менее 7 последовательных градацийтитров антител, чтобы обеспечить достаточный цифровой набор значений диагностического критерия в форме индекса специфического повышения титраантител. Большему числу градацийвыявляемых титров антител соответствует более высокая чувствительностьпрепарата, Такой подход дает основание, для упрощения технологии коммерческого производства эритроцитарных антигенных диагностикумов дляРИГА,Существенное улучшение диагности.ки инфекций обеспечивается применением существующих диагностических1492280 13 ИндекскМСр.т,Ср.тСоставитель П.Бонарцев Корректор В .Гирняк Редактор И.Горная Техред Л.Олийнык Заказ 3871/47 Тираж 789 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 препаратов без изменения техники их применения, Это дает воэможность не-. медленного применения изобретения в здравоохранении без дополнительных5 средств и затрат на его реализацию.Единственное усовершенствование, которое целесообразно ввести, это выпуск диагностического набора препарата со специфическим антигеном в соче танин с заранее отобранным диагностикумом с неспецифическим антигеном, что вполне возможно на основании использования существующих коммерческих диагностикумов. 15 Формула изобретенияСпособ иммунодиагностики инфекций путем определения титра специфических антител в сыворотке крови пациента в реакции пассивной гемагглютинации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и ранней диагностики,в начале заболевания дополнительно определяют титр антител к неспецифическому антигену и титры антител к специфическому и неспецифическому антигенам у здоровых лиц с последующим вычислением индекса по формулеТп Т нб со бгде Т- титр антител к специфичес"кому антигену у пациента;Тяе- титр антител к неспецифическому антигену у пациента;кСр.Т- средний титр антител к спе"цифическому антигену у здоровых лиц;кСр.Тяеся- средний титр антител к неспецифическому антигену уздоровых лиц,и при значении индекса больше 4 диагностируют наличие инфекции.