Способ количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей

(51)4 С 01 М 3 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(7) Московская сельскохозяйственная академия им. К,А. Тимирязева (72) И.К. Блиновский, В.П, Тучков, Г,Л, Соркина и 10.А. Бунятян (53) 543.54.42(088,8)(56) 1)ег.епп 1 паг.1 оп оГ ЭАБ 083 (Б,Бвегпу 1 р.реп.й 1 п 1 цп) сЫогЫе) гея)л 1 це ).и соггопяеедв, соггоп Когане, яох 1, соггопяеей ргосеяе Угаси,1 опя, Ьеей г 1 вяцея, сЫсКеп г 1 яяцея, пп 11 апй е 88 в. - Апа 1 уг 1 са 1 МейЬой, Ю 823, Ос гоЬег 3, 1977. 1)ече 1 орей Ву: Е 1)С А 8- г 1 сц 1 гцга 1 СЬеппса 1 в Кев 1 дце 1,аЬогагогу, Рага 1 ррапу, Беы Логвеу; ВАБР А 1 свг 1 еп 8 еве 11 всЬаГГ, А 8 г 1 сц 11:цга 1 Ехрегппепг Баг 1 оп, 1,ппЬцг 8 егЬо 1, Уеяг Сеппапу.Авторское свидетельство СССР У 767639, кн. С 01 И 31/08, 1980,(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ ЧЕТВЕРТИЧНЫХ АММОНИЕВЫХ СОЛЕЙ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей, и может быть использовано для определения в биологических объектах хлорхолинхлорида, хлорида морфола или морфонола, Повышение селектнвности определения с помощью экстракции растворителем и пропускания экстракта через адсорбент достигается использованием другого растворителя для элюирования - 0,9-1,17-ного раствора НС 1 с в воде и адсорбента - силикагеля, который перед элюированием обрабатывают 45-553-ным водным раствором ацетона со скоростью 30-40 мл/мин, Далее Се злюат хроматографируют в тонком слое, Способ позволяет определять пикс, хлор- - холинхлорид,и морфол в концентрации 0,5 мкг, а морфонол " 1 мкг. 5 табл.Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению регуляторов роста растений методом твердожидкостной хроматографии, и может использоваться в химических и биохимических лабораториях для обнаружения и определения содержания в биологических объектах хлорхолинхлорида, М-диметилморфолиний (хлорида морфола), Н,Н-дигидро(оксиэтил)-морфолиний хлорида (морфонола) и Б,И-диметилпиперкдиний хлорида (пикса).Цель изобретения - повышение селективности способа.Способ осуществляют следующим образом (концентрации растворов ацетона и этанола даны в объемных % в воде, концентрация всех других растворов дана в массовых % в воде), Навеску 50 г измельченного образца экстрагируют 80%-ным раствором этанола в воде при малом содержании углеводов и высоком липидов, например семян масличных культур, или 80%-ным раствором ацетона в воде при высоком содержании углеводов и малом липидов, например плодов фруктовых и ягодных культур, в анализируемом материале, Этанол и ацетон предварительно подкисляют со - ляной кислотой до рН 2,0. Экстракт в полном объеме очищают от липидов гексаном и пропускают через колонку с силикагелем со скоростью 2-3 мл/мин, Силикагель промывают от коэкстрактивных веществ 150 мл 45-55%-ного ацетона в воде со скоростью 30-40 мл/мин Хлорхолинхлорид и другие органические катионы, осевшие в микропорах силикагеля, элюируют из последнего 250 мл 0,9-1,1%-ного раствора соляной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин, Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды и наносят микропипеткой 0,1 мл на хроматографическую пластинку с тонким слоем катионита, Осуществляют развитие хроматограммы восходящим потоком 21,0-25,0%-ным раствором серной кислоты или 3,0-5,0%-ным раствором соляной кислоты. Для проявления разделенных четвертичных солей аммония хроматографическую пластину без просушки обрабатывают 10,0-12,0% - ным раствором фосфорномолнбденовой кислоты и после промывки водой 0,8-1,2%-ным раствором двухлористого олова, После просушивания пластинки просветляют вазелиновым маслом и измеряют оптическую плотность окрашенных пятен солей аммония на спектрофотометре впроходящем свете прн 20-740 пм. Количество определяемых регуляторов5 роста растений, являющихся четвертичными солями аммония, определяют поградуировочному графику, которыйстроят в период проведения подготовительных операций, осуществляемых0 следующим образом,На аналитических весах взвешиваютпо 1,00 г химически чистых регуляторов роста с точностью до 0,01 г. Навески переносят в мерную колбу на500 мл и растворяют в 0,2 н. солянойкислоте, доводят объем до метки. Спомощью бюретки переносят в 4 мерныеколбы на 500 мл соответственно 5, 15,25 и 35 мл полученного стандартногоматочного раствора и разбавляют до500 мл дистиллированной водой,На катионитовые пластины размерами70 х 100 мм параллельно одной из меньших сторон пластинок и на расстоянии15 мм от края мягким карандашом проводят стартовую линию, на которую наносят с помощью микропипеток разбавленные стандартные растворы по 0,05 млв порядке увеличения их концентрации,30что соответствует количеству определяемых регуляторов роста по зонам соответственно 1,0:3,0; 5,0:7,0 мкг.Этот процесс выполняют в трехкратной повторности (3 пластинки),В хроматографическую камеру наливают 21,0-25%-ный раствор сернойкислоты и устанавливают в него катионитовые пластинки на ребро, вдоль которого нанесены определяемые регуляторы роста. После поднятия фронтараствора кислоты на высоту 80 мм отстартовой линии пластинки вынимаютиз камеры,Для проявления хроматограмм опускают пластинки на 3/4 их высоты в10,0-12,0%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в воде, выдерживают2-3 с и промывают в 6 порциях воды(первые 5 - водопроводная, а последняя - дистиллированная), выдерживаяв них пластинки по 5 мин,После промывки пластинки осушают фильтровальной бумагой, не касаясь катионита выше стартовой линии, и обрабатывают. 0,8-1,2%-ным раствором двухлористого олова в воде аналогично первой процедуре, увеличивая выдержку до полного развития окраски1295 хроматограмм, На светло-голубом фонеобразуются темно-синие пятна восста-,новленных солей фосфорномолибденовыхопределяемых регуляторов роста.Проявленные хроматограммы высушивают под феном и просветляют вазелиновым маслом посредством мазков мягкой (беличьей) кисточкой не менее,чем за 1 ч до измерения их оптической плотности. Измеряют оптическуюплотность проявленных пятен хроматограмм относительно окружающего фонапластин в проходящем или отраженномсвете при 720,0-740,0 нм.Строят градуировочный график, откладывая по абсциссе количества нанесенных на пластинку регуляторов роста в мкг, а по ординате - соответствующие им величины оптических плотностей пятен хроматограмм, и вычисляют коэффициенты пропорциональности.Приготовление колонок с силикагелем. Из мелкопористого силикагелямарки МСМ выделяют фракцию 0,5-1,5 ммпросеиванием, Закрепляют на штативе25стеклянные хроматографические Колонки высотой 300 и диаметром 11-13 мм.Заполняют колонки на 1/2 высоты дистиллированной водой и затем через воронку засыпают силикагель, постуки 30вая по колонке стеклянной палочкой.Высота уплотненной набивки силикагеля должна быть 145-155 мм.Устанавливают на колонки питающиесосуды и промывают силикагель 1 л2,0 н, соляной кислоты со скоростью2-3 мл/мин, заполненные растворомкислоты колонки выдерживают 1 сут, азатем повторяют промывку в том же ре 40жиче. После кислотной промывки проводят промывку колонок дистиллированнойводой до нейтрального показателя рНпо индикаторной бумаге.Смену промывочных жидкостей, а так 45же последующие внесения анализируемыхрастворов осуществляют при высоте предыдущей жидкости над слоем сорбентана 0,5-1,0 см,Устанавливают рабочие объемы ацетона (для промывки колонок и солянойкислоты (для вытеснения определяемыхвеществ), пропуская через колонки соскоростью 2-3 мл/мин 40 мл водного.раствора, содержащего по 80-100 мкгопределяемых регуляторов роста. Проход собирают в плоскодонные колбы на250 мл. В том же режиме собирают 4порции элюата по 50 мл 45,0-55,07-но 336 4го раствора ацетона в воде. Вымывают адсорбированные силикагелем регуляторы роста 0,9-1,17.-ным раствором соляной кислоты, собирают в 250 мл, плоскодонные колбы со скоростью 2- 3 мл/мин 4 порции: первая 150 мл и три последующих по 50 мл.Собранные порции элюатов выпаривают досуха в ротационном испарителе. Сухие остатки в колбе после охлаждения до комнатной температуры растворяют в 0,1-0,2 мл воды и в полном объеме наносят на катионитовые пластинки. Размер пластинок, нанесение и получение хроматограмм такие же, как при построении градуировочного графика.На основании полученных результатов определяют рабочие объемы, например, для хлорхолинхлорила: первый для промывки колонок, (от коэкстрактивных веществ при выполнении анализов), равный сумме объемов порций 45-557- ного ацетона, в которых не обнаружены регуляторы роста, и второй для вытеснения адсорбированных регуляторов роста, равный сумме объемов порций 0,9-1,1 Х-ного раствора соляной кислоты, в которых обнаружены определяемые регуляторы роста. Например, в 45-557. - ном ацетоне обнаружен препарат в четвертой порции, а в 0,9-1,1 Ж-ном растворе кислоты - в 1,2 и 3 порциях. Следовательно, промывать колонки от коэкстрактивных веществ нужно объемом не более 150 мл 45,0-55,07-ного ацетона, а вытеснять адсорбированные препараты - объемом не менее 250 мл 0,9-1,17-ной соляной кислоты, Первая порция прохода воды при внесении раствора препарата в колонку нужна для контроля полноты адсорбции силикагелем определяемых регуляторов роста.Колонки, промытые дистиллированной водой от соляной кислоты, готовы к работе. Подготовленные и апробированные таким образом колонки с силикагелем могут использоваться постоянно без замены набивки, но не реже 2 раз в год проверяют и уточняют рабочие объемы для промывки и вытеснения определяемых регуляторов роста.П р и м е р 1. 50 г анализируемой средней пробы, измельченной на гомогенизаторе до размера частиц не более 1 мм, вносят в экстрактор, заливают 200 мл 807-ного этанола или129533 б 3807.-ного ацетона, подкисленных дорН 2 по индикаторной бумаге,и осуществляют процесс экстрагирования втечение 6 ч, Экстракт фильтруют черезбумажный фильтр в делительную воронку на 500 мл и смешивают с 50 мл гексана путем энергичного встряхиванияв течение 5 мин. После расслоениянижнюю фазу сливают в другую делительную воронку и повторяют процесс 10очистки новой порцией гексана. Операцию повторяют до получения бесцветного гексанового слоя,Очищенный гексаном экстракт (нижняя фаза) пропускают через колонку 15с силикагелем со скоростью 2-3 мл//мин. Промывают колонку со скоростью30-40 мл/мин 507.-ным раствором ацетона в воде с объемом, который установлен при апробации колонки. Поглощенные силикагелем регуляторы ростаэлюируют 1,07-ным раствором солянойкислоты со скоростью 2-3 мл/мин объемом, который также установлен приапробации колонки. Солянокислый элюат собирают в плоскодонную колбу на250 мл и выпаривают досуха (например,на ротационном испарителе).Сухой остаток растворяют в 0,5 млдистиллированной воды, и 0,1 мл полученного раствора с помощью микропипеток в двукратной повторности наносят на катионитовую хроматографическую пластинку. Нанесение и вседальнейшие операции выполняют так,как при получении градуировочногографика.Содержание остаточных количестврегуляторов роста в анализируемойпробе вычисляют по формуле 40С = 5 А " Мгде С - содержание в пробе хлорхоХлинхлорида мг/кг или мг/л;5 - коэффициент, .равный отношению объема раствора сухого 45остатка экстракта (0,5 мл)к объему этого раствора, нанесенного на хроматографическую пластинку (0,1 мл);А - количество хлорхолинхлорида, 0обнаруженное на хроматограмме, мкг по градуировочномуграфику;М - масса или объем анализируемой пробы, г или мл. ЬП р и м е р 2. Определение проводят аналогично примеру 1, но промывку колонок осуществляют 457, - ным раствором ацетона в воде и 0,97-ным раствором соляной кислоты.П р и м е р 3. Анализ проводят, используя 55%-ный раствор ацетона и 1,1%-ный раствор соляной кислоты. Результаты влияния концентрации ацетона в промывочном растворе на уменьшение содержания загрязняющих коэкстрактивных веществ (г) в элюате четвертичных солей аммония приведены в табл. 1. В табл. 2 приведены результаты влияния концентрации хлористоводородной кислоты на активность вымывания с 250 мл элюата адсорбированных силикагелем четвертичных солей (%). Результаты определения препаратов четвертичных солей аммония и коэффициенты их поцвижности приведены в табл, 3 и 4,П р и м е р 4. Проводят анализ аналогично примерам 1-3, определяя стабильность и воспроизводимость результатов определений. Данные о стабильности сорбции мелкопористым силикагелем определяемых регуляторов роста при многократном использовании 200 определений) приведены в табл.5,Формула изобретения Способ количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей путем экстракции их органическим растворителем, пропусканием экстракта через колонку с адсорбентом, элюированием растворителем с последующим тонкослойным хроматографированием элюата, о тл и ч а ю щ и й с я. тем, что, с целью повышения точности и селективности определения, в качестве адсорбента используют силикагель, передэлюированием адсорбент обрабатывают45-55 об,7 раствором ацетона и в качестве растворителя используют 0,91,1 мас.7, раствор соляной кислоты вводе.1295336 Таблица 1 Анализ ируемыйматериал Концентрация ацетона, об.7. 10,0 20,0 30,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 70,0 1,32 0,96 0,68 0,56 0,54 0,48 0,48 0,49 0,64 2,24 1,64 1,24 0,92 0,89 0,84 0,90 1,04 1,36 1,80 1,28 0,96 0,72 0,70 0,64 0,71 0,76 0,97 КартофельЯблоки Томаты Таблица 2 Концентрация кислоты, мас.7 Соли аммония 0,20 0,40 0,60 0,80 0,90 1,00 1,О 1,20 1,40 93 94 Морфол 53 64 75 86 8991 92 92 92 61 70 81 84 88 90 91 90 90 Пикс Морфонол Таблица 3 Внесено мкг Обнаружено, мкг Препарат Известный способ Предлагаемый способ блоки Томаты Ж обнаруже- Яблоки Томаты 7. обнаружения ния 0,0 10,0 Н/о Н/о 8,3 8,9 Пикс 20,0 Следы Следы 0,0 17,1 18,4 10,0 8,7 81-87 8,1 8,2 8,7 Хлорхолинхлорид10 Та блица 4 Коэффициент подвижности Вещество Я,Н-Диметилпиперидинийхлорид (пикс) 0,13-0,15 2-Хлорэтилтриметиламмоний хлорид (хлорхолинхлорид) 0,21-0,25 Б-Диметилморфолиний хлорид (морфол) 0,29-0,31 0,35-0,37 Холин Триметиламин хлоргидрат 0,36-0,38 П р и м е ч а н и е. Пределы обнаружения для пикса, хлорхолинхлорида и морфола равны 0,5 мкг, а для морфонола 1,0 мкг. Таблица 5 Расхождение Х Сорбцня силикагепя после 200 определений орбция свежим силикагелем бъем 45-553 Объем 45-557 Выход вещества с 0,9- 1,1 Х-ной соляной кислотой (250 мл),мкг ного ацетонадо начала вы" тода в а, мл лоты,7-9,450-55 450-550 9 2,Количествовведенноговещества в колонку с силикагелем, мкг ого ацетонао начала выода вещества,8,1-9,724,9"29,141,8-38,4 22,1-24,40,8-48,Выход вещества с0,9-1 1 Ж- ной соляной кислотой12 1295336 Продолжение табл. 5 Расхождение, Х Сорбция свежим силикагелем Сарбция силикагеля пос"ле 200 определений Объем 45-55%Объем 45-55%объема45-55 Х"ного ного ацетонадо начала выхода вещества,мл ацетона Б,М"Диметилпиперидиний хлорид450-550 8,5-9,9 450-550 О 26,0-29,2 45,1-50,5 50 вЬ ю Составитель С. Хованская Редактор О, Бугир Техред, А.Кравчук Корректор А. ЗимокосовЗаказ 613/52 Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Количество введенного вещества в ка ланку с силикагелем, мкг Выход вещества с 0,91,1%-най соляной кислотой (250 мл),мкг ного ацетонада начала выхода вещества, мл Выход вещества с0,9-1,1 Хной соляной кислотой