Способ определения урата в плазме и сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН РВ 6 01 Я 33/48; ТЕНИЯ УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОТОйМУ СВЩЩЪС 21) 3303842/28-13 (22) 17.04.81 (46) 30.03.83. Вюл. Р 12 72) В.И. Ригин (53) 543.9(0888) (56) 1. Патент Великобритании Ю 1456925,. кл. 6 1 В, опублик; 1976.2. Н 1 пзсЬ М, Ап 1 опЦу 1 с А., Вцпйагаа Р,7. "ТЬе Бзе оЕ 1 вщоЬ 111 гей Уг 1 сазе/А 1 йеЬуйе ПеЬуйгодепазе Му 1 опТцЬе Кеасйогз 1 п йЬе Ацйовайед ОеФег" а 1 па 11 оп оз. Бг 1 с.Асад 1 п егщп", Ргезепхцз 2 е 1 гзсЬгИ Юбг Апа 1 уй 1. зсЬеп СЬеа 1 е1980, 301, 161.3. Ригин В.И. хемилюминесцентный метод определения микроколичеств хо лестерина с помощью йммобилизированных ферментов. - журнал аналитической химииф, 1978, е. 33 вып 8, с 1623 1630 " цф а(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРАТА В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ, предусматривающий контактирование исследуемой пробы с уриказой и каталазой при рН 8-8,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чуб, с целью повышения еелективности определения и упрощения процесса, пробу первоначально вводят в контакт с каталазой,аззатем с уриказой, иммобилизованными на пористом стекле содержащем покрытие из пентоксида ниобия, с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегося пероксида водорода, по которому определяют количество урата.31008657 раствор пропускают через кювету для Фотометрического анализа, фотометрируют при 420-4 б 0 нм 1К недостаткам данного способа относятся длительность анализа, так как диализ растворов - процедура крайне длительная, малая точность определения, так как фотометрированию мешают все содержащиеся в крови окрашенные соединения, большой расход Ферментов, иэ-за чего стоимость анализов высока,.что не позволяет использовать способ для массовых анализов.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения урата в плазме и сыворотке крови, заключающийся в пропускании исследуемой пробы при рН 8-8,1 через нейлоновый трубчатый реактор, на стенках которого. иммобилизованы уриказа и альдегиддегидрогеназа. Кроме того, в реакционную среду непосредственно вводится фермент каталаэа ураг 1 О -- аллантоинурикаэакаталаэаН 202 + этанол ацеталАцетальдегид + НАД+ СО 2 + Н О2 2 фермента, и тем, что никотинамидадениндинуклеотид принадлежит к числу очень дорогих и скоропортящихся реактивов, его использование резко удорожает анализ.Кроме того, иммобилизованные на поверхности нейлонового реактора ферменты сравнительно легко вымываются анализируемым раствором, ферменты теряются и активность реактора уменьшается, срок службы такого фермент- ного реактора не превышает 20 дней.Цель изобретения - повышение селективности определения и упрощение процесса.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения. урата в плазме и сыворотке крови, заключающемуся в контактировании исследуемой пробы с урикаэой и ката лаэой при рН 8-8,1, пробу первоначально вводят в контакт с каталазой, а затем с уриказой, иммобилиэованными на пористом стекле, содержащем покрытие иэ пММтоксида ниобия, с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегося пероксида водорода,по которому определяют количество урата.указанная последовательность стадий процесса, а также применение описанных иммобилизованных форм ферментов обеспечивают возможность максимального устранения побочных реакИзобретение относится к клинической биохимии, а именно к разделу клинического медицинского анализа.Урат принадлежит к числу обязательных компонентов крови, в норме содержание урата в плазме крови сос тавляет 0,02-0,04 г/л. Уровень содержания урата в крови имеет важное диагностическое значение, повышенное содержание его характерно, например, для заболеваний подагрой, резкие коле 0 бания содержания урата в крови наблюдаются при почечнб-каменной болезни.Известен способ определения урата в плазме и сыворотке крови, состоящий в том, что анализируемую пробу разбавляют раствором типа физиологического, подвергают диализу, смешивают диализат с раствором фермента урика-. зы, растворенного в водной буферной смеси с рН 8,5-10, инкубируют полученный раствор при 37 С в течение 4 мин, смешивают инкубированныйраствор с водным раствором замещенного бенэидина или дифенилина, с водным раствором фермента пероксидазы и с водным буферным раствором25 с рН 5,5-8,5, полученный окрашенный где НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид в окисленной Форме;НАНД - никотинамидадениндинуклеотид в восстановленнойформе,Содержание урата находят, измеряясодержание ионов водорода, образующихся в последней реакции Г 2 . 40Иммобилиэованные уриказа и альдегиддегидрогенаэа позволяют проводитьмногократные определения урата с.одной и той же порцией фермента, благодаря чему уменьшается расход ферментов и снижается стоимость анализа,Простота регистрации отклика даетвоэможность автоматизировать определение.Недостатки способа заключаются втом, что малая реакционная поверхность нейлонового реактора-трубкизамедляет основные реакции, из-зачего возникает много побочных реакций, приводящих к ошибкам в результате анализа.Большой ассортимент вводимых ванализируемый раствор реагентов связан с возможностью протекания разного рода побочных реакций, искажающих результат анализа и снижающих 60селективность определения. Реализация способа усложняется также необходимостью введения в анализируемыйраствор фермента каталаэы, котораяприводит к необратимым потерям этого 65 Способ основан на последовательнопротекающих Ферментативных реакциях ъдегид + НОдрогеназаацетат + НАДН + Н+ций, что позволяет повысить селективность определения, а также упростить процесс, поскольку его осуществление основано на двух а не трех)ферментативных реакциях, Кроме того,используемые иммобилизованные ферменты являются, стабильными и обеспечивают большую продолжительность использования. Данный способ для реализации не требует использования НАД,Процесс основан на следующей схеме. 10Фермент уриказа (уратоксидаза,урат: 02 оксидоредуктаза, К.Ф,1.7.3,3)катализирует реакцию окисления уратакислородом с образованием аллантоинаи пероксида водорода 15урикаэаурат + 0 ---аллантоннтнтсаКоличество образовавшегося пероксида водорода эквивалентно количеству прореагировавшего урата. Насыщение буферного раствора, в которомпроводят ферментативную реакцию, кис.лородом обеспечивает практическимгновенное протекание этой реакции.фермент катализа разлагает все перекисные соединения, которые могут присутствовать в анализируемом веществе, с образованием кислорода, и темсамым устраняет возможность ошибки,вызванной взаимодействием этих перекисных соединений с люминесцентнымреагентом,При использовании хемилюминесцентного метода 3 3 пероксид водородаподвергают реакции с замешеннымиарилоксалатами, образуя пероксиокса- З 5латы, которые мгновенно распадаются, причем распад сопровождаетсяяркой хемилюминесценцией, интенсивность которой пропорциональна кон-.центрации пероксида водорода в растворе, В присутствии флуоресцентныхреагентов с сопряженными двойнымисвязями типа антрацена или периленаяркость свечения резко возрастает,что облегчает регистрацию хемилюминесценции.Способ осуществляют следующим образом,Пробу анализируемого веществавводят в поток насыщенного кислородомФосфатного буферного раствора с рН 8,проходящий последовательно черездве колонки с ферментами, иммобилизованными на покрытых пентоксидом ниобия шариках из пеностекла, причем впервой колонке находится фермент каталаза, во второй - Фермент уриказа,и в выходящем из второй колонки растворе определяют содержание пероксидаводорода хемилюминесцентным методом3по реакции с бис-(3,4,б-трихлорфенил)-оксалатом в присутствии 910-дифенилантрацена, по найденному содержанию пероксида водорода рассчитывают содержание урата в анализируемомвеществе. Экспериментально установлено,что наилучшие результаты дает применение в качестве хемилюминесиентного реагента бис-(3,4,б-трихлорфенил)-окса- лата, а в качестве флуоресцентного реагента 9,10-дифенилантрацена.Эта реакция дает возможность по интенсивности свечения определять очень малые количества пероксида водорода, благодаря чему резко снижается требуемый объем анализируемого. вещества (для единичного определения достаточно 50 мкл плазмы или сыворотки крови, против 10 жп по обычно используемому методу, т.е. в 200 раз меньше), Введенная в поток буферногораствора проба анализируемого вещества разбавляется много раз при этих: разбавлениях окрашенные компоненты крови не оказывают никакого статистически значимого влияния на результат определения. На реакцию пероксида водорода с замещенными арилоксалатами не влияют белковые вещества, поэтому не требуется операция диализа анализируемого раствора., Измерение хемилюминесценции может проводиться в автоматическом режиме.Иммобилизацию ферментов проводят следующим образом.100 вес,ч. шариков из пеностекла, имеющих средний диаметр 0,25-0,35 мм и средний диаметр пор 200-500 нм высушивают в вакуумном сушильном шкафу при 150 С и остаточном давлении 0,1 Па. Затем высушенные шарики помещают в кварцевы. стакан, заливают 150 вес.ч. 1-ного раствора пентахлорида ниобия в безводном этиловом спирте, стакан устанавливают в вакуумэксикаторе и откачивают воздух до начала .кипения жидкости. в стакане, повторяют процедуру откачивания воздуха 5 раз. Далее стакан вынимают из вакуум-эксикатора и при интенсивном перемешивании содержимого стакана . пропеллерной мешалкой вливают в стакан 150 вес.ч, воды, Перемешивают массу в течение 30 мин, дают отстояться, декантируют жидкость и приливают новую порцию 150 вес.ч, воды. Вновь перемешивают 30 мин, отсасывают шарики на воронке Бюхнера, промывая буферным раствором с рН 10. Промывку повторяют 3 раза. Промытые шарики готовы к употреблению, их хранят в Фосфатном.буферном растворе с рН 8.Для иммобилизации растворяют 1 вес,ч. Фермента в 200 вес.ч. буферного раствора с рН 10,5, в полученный раствор вносят 8 вес,ч, шариков иэ пеностекла, покрытых пентоксидом ниобия, и оставляют в растворе на 24 ч при интенсивном перемешивании смеси магнитной машалкой, при 35- 37 С . Затем шарики отсасывают на воронке Бюхнера, промывая Фосфатнымбуферным раствором с РН 8, промытые шарики до употребления хранят в фосфатном буферном растворе с РН 8 при 4 С.В колонку для проведения Ферментативной реакции загружают шарики 5 с иммобилиэованным ферментом с таким расчетом, чтобы высота слоя шариков была в пределах 35-45 мм. Для прове" дения измерений используют установ ку (ЗД, 1 ОП р и м е р 1. Определение урата в образцах крови.Анализу на содержание Урата подвергают образцы плазмы и сыворотки донорской крови стандартного консер вирования, а также плазму и сыворотку крови больного почечно-каменной болезнью на разных стадиях болезни.Для анализа собирают установку 3, Иммобилиэуют ферменты, как описано 20 выше, загружают шарики с иммобилизо ванными ферментами в колонки, устанавливают постоянный поток буферного раствора через систему, включают регистрирующую установку и пРоводят 25 корректировку нуля измерительного прибора.Отбирают 200 мкл анализируемого образца (плазмы или сыворотки) в шприцевый микродоэатор и далее последовательно проводят три определения, вводя.в установку по 50 мкл анализируемого образца и измеряя интенсивность хемилюминесценции. Содержание урата определяют по градуировочному графику, 35Параллельно те же образцы анализируют на содержание урата способом- прототипом с использованием иммобилиэованных на поверхности нейлоновой трубки-реактора Ферментов уриказы 40 и альдегиддегидрогеназы, также повторяя анализ три раза.Полученные в эксперименте результаты обрабатывают следующим образом.По табл, 1, в которой приведены результаты изучения влияния концентрации урата в анализируемом растворе на величину интегрального значения интенсивности хемилюминесценции, возникающей на кОнечнОм этапе Определе 50 ния урата, строитея градуировочный график в билогарифмических координатах (см, чертеж) . В диапазоне содержаний урата в пробе анализируемого раствора 2 10-8-. 8 10 4 моль/л зависимость имеет линейный характер ие тодом наименьших квадратов найдено уравнение прямой, описывающей зту зависимостьРС = 9,5852 - 1,1733 1 где рс - отрицательный логарйфммолярвой концентрации урата;ф - интегральное значение инхп тенсивности хемилюминесценции, выраженное через токФотоумножителя, НА с. Таблица 1 Эависимость интегральной интенсивности хемилюминесценции Щ 3) от концентрации урата в аналиэируГмом ра- створе Величина ЯЗ НА с средн 1 ее из 5 измерений Концентрация урата, моль/л 2,0103,01040105,0108,0101,00, 102,00 10 84;00 10 85 0010800101,00 1020010-14,00 10 75,00 101,00 102,00 104,00105 00108 уоо 101,оо 10-52 00 104,оо - 10-45 роо108, 00 1(Г1,оо злг 42 роо 104,00 10 45,оо10-48,00 10 ф1 00 10 14,46,514 р 94,415 43,616,7 ,.3.19(9 + 3,022,9 + 2,939,82 р 872,4 1 3,988,7 + 6,71008657 Т аблиц а 2Определение урата в образцах крови Образец прототипом предлагаемым Г Плазма 1 7,6 7,7 0,0 6 0,0 0,0 24,8,6 9,3 ротка 10,0 53,2 68,5 52,668 приступа время приступ Оф в 0,04 37,период ремиссии Затр 1 оп а времени на деление, мин 5 и м е ч а н длагаеьыйости опреболее сохраермент споль анав-,оготечеремеа 3 Т а держивание ферм на носителе йдено урата в образ способо/л 1 я,Ш ШВШШШС, мг/л Б . С, мг 0,0 0 0 0,04 24,3 24 с 4 4,1 3 Как видспособ неделения изпростым иПримжания фермекения постоного реактозовании.Собиравливают посраствора чении определ о из табл. 2 преуступает по точиестным, являетсяелективным.е р 2. Сравнениентов на носителе иянства активностира при длительномустановку 3, Усоянный поток буФеррез реакторы, по иенного промежутка Найдено урата, мг/л, способом С среднее содержание урата,Я - относительное стандартное отклонение. ни анализируют один и тот же образец плазмы крови с известным содержанием урата.Параллельно собирают установку по способу-прототипу с нейлоновым трубчатым реактором, устанавливают постоянный поток буферного раствора через реактор, равный потоку буферного раствора в способе-прототипе, Через те же саьые промежутки времени анализируют тот же самый образец плазмы крови.Результаты представлены в табл.3.10 1008657 Продолжение табл. 3 Время непрерывного промывания реактора буферным раствором,ч Найдено урата в образце плазмы кРови, мг/л,способом прототипом3 : . предлагаемым С, мг/л:1 С, мг/л 24,2 .24,4 24,5 24,3 24,2 24,3 24,4 12 22,1 18, 53,8 Не обнаружено Не обнаружено 0,06 0,03 0,04 0,03 0,04 0,03 0,03 0,04 24 48 72 96 120 144 0,12 0,55 Не обнаружено Не обнаружено Предлагаемый способ после 144 ч тру ферментных реакторов равной промывания ферментных реакторов бу С и оставляют при этих условиях ферным раствором показывает одинако- на задавное время. Через заданный вые с исходным результаты определе промежуток времени включают установния содержания урата в образце плаз- ку и проводят определение урата в мы крови, плазме крови, как описано выше,Способ-прототип после 24 ч промывания реактора буферным раствором Параллельно готовят ферментный дает колеблющиеся результаты после РеактоР по способу-прототипу иммо 30Р 48 ч промывания реактор полностью билизуя уратоксидаэу и альдегиддегидтеряет активность и определение ста- рогеназу на внутренней стенке нейлоновится невозможным. новой трубки. Готовый ферментный реакП Р и м е р 3, Влияние срока хра- тор заливают буФерным раствором и нения ферментного реактора с иммоби- погружают в аермостат с температурой лизованными Ферментами на результат З 5 4 С, хранят в этом термостате. Черезоопределения урата в плазме крови. заданный промежуток времени реакторСобирают установку 3, Иммобили- вынимают из термостата., устанавливают зуют ферменты на шариках их пеностек- температуру реактора равной 37 С и ла, покрытых пентоксидом ниобия, проводят определение, как описано загружают шарики в реакторы, подклю в способе-прототипе. чают реакторы к установке. Полностью.готовую к работе установку подключа- Полученные результаты представлеют к термостату,устанавливают темпера- ны в табл. 4.Таблица 4Влияние срока хранения ферментного реактора на результатопределения содержания урата в плазме крови Найдено урата, .мг/л, способом Срок хранения, мес предлагаемымся прототипом24,1 0,03 24,3 0 04 24,4 0,05 23,8 0,05 24,1 0,04 15,1 0,48 0,05 Не обнаружено 0,05 Не обнаружено 0,04 Не обнаружено 0,05 Не обнаружено 23,7 23,6 10 24,0 12 24,212 1008657 Составитель О. СкородумоваРедактор А. Лежнина Техред И.Гайду Корректор Л. Бокшан. Заказ 2330/55 Тираж 871 ПодписнбеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4Хранение ферментного реактора с ферментами, иммобилизованными на .шариках иэ пеностекла, покрытых пентоксидом ниобия, в течение года не сказывается на активности ферментов и не влияет на результат анализа, в то время как ферментный реактор, изготовленный в соответствии со способомпрототипом, через 4 ыес хранения дает непригодные результаты, а через 6 мес полностью теряет активность. Преимущества предлагаемого способапо сравнейию с прототипом состоят в том, что вместо трех.ферментов для анализа требуется только два, ферментный реактор служит дольше (не менее 5 12 мес. против 4 мес. по способу-прототипу),. затраты времени на анализ в 2 раза меньше, исключается применение дорогих и скоропортящихся реактивов тина никотннамидадениндинуклеотида, отсутству ют помехи от окрашенньх вещестВ, определение легко автоматизируется,