Способ определения областной трансформации лимфоцитов

(ГОСПАТЕНТ СССР) ИЕ ИЗОБ СВИДЕТЕЛЬС ВТОРСКО ков, А.Д. Черно 1 ИЯ БЛАСТНОЙ ФОЦИТОВ ся к клинической шение точности и об определения осуществляют пуакци ихибо0 - 5дир дозе 3 суспен среде вят не вается опыте Сп(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМ(57) Изобретение относитиммунологии, Цель - повыускорение способа. Спосбластной трансформации Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике иммунопатологических состояний, сопровождающихся нарушением бласттрансформации лимфоцитов периферической кроеи.Известен способ определения РБТЛ в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), Для этого готовили пул клеток-стимуляторов пул отвечающих клеток. Клеточную (мононуклеарную) суспензию и в том, и в другом случаях получают стандартным способом седиментации разведенной гепаринизированной крови на градиенте ГсоИ-Ро 9 це(о =3=1,077 г/см ). После двукратного отмь 1 вания составляется клеточная суспензия в концентрации 1 10 /мл. Далее возможны два вари 6анта постановки реакции - сингенный и аллогенный. 8 случае сингенного вариант в качестве клеток-стимуляторов используются аутологичные лимфоциты, в случае аллогенного варианта используются лимфоциты другого донора, либо смесь лимфоцитов, полученных от не менее чем 10 различных доноров.Для блокады пролиферативного ответа клеток-стимуляторов по всех вариантах ре 51)5 0 01 М 33/53, С 12 й 5 тем инкубации мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, в качестве которого используют культивируемую и адыго клеточную линию Вар, обработанную предварительно 0,8 - 1,2/, раствором параформальдегида при соотношении клетки Вар: мононуклеарные клетки равном 0,8 - 1,2;1 и концентрации клеток 2 - 4 10 /м и инкуба 6цию проводят в течение 48-50 часов. Предложенный способ определения РБТЛ . сокращает время и увеличивает точность анализа. 5 табл. подвергают облучению в до обрабатывают митомицином С 0 мкг/мл. После отмывания и р ования в полной питательн ышеуказанной концентрации ст средственно СКЛ. Результат учит уровню включения Н-тимидина онтроле (1),об имеет следующие недостатки1, Ограниченная сфера применения способа, исчерпывающаяся в основном областью трансплантационной иммунологии,2, Низкая точность способа, т,е. культивирование мононуклеаров на пластике без стимуляции в течение 7 дней индуцирует спонтанную бласт-трансформацию лимфоцитов и вследствие этого высокий уровень включения изотопа,3, Длительность осуществления способа - 168 ч и необходимость создания условий для асептической работы.4. Непригодность способа п ри и роведении иммуноэпидемиологических исследова- ний 5. Отсутствие стандартизации испол нея способа.Наиболее близок к предлагаемому способ определения РБТЛ периферической крови человека, Способ заключается в следующем; периферическую гиперанизированную кровь разводят питательной средой (199 или РРМ 3-1640), либо в сбалансированном солевом растворе (р-р Хенкса без Са+2 и М 9+, РВЯ) в соотношении 1:2 и наслаивают на плотностной градиент Нсо-Рацое (б = 1,077 г/см ),После центрифугирования в режиме250 9, 30 мин, 20 С собирают интерфазу, , дважды отмывают и ресуспендируют в полной питательной среде(ППС) известного состава; среда РРМ,-1640+10 ЭТС + 2 мМ глютимина+ буфер ГЭПЭС 2 мМ+ гентамицин 80 мкг/мл с концентрацией клеток 2 х х 10 /мл. Суспензию мононуклеарных клеток в ППС раскапывают в лунки круглодонных планшет для иммунологических реакций, общий объем доводят до 0,2 мл. В лунках "Контроль" инкубируются чистые мононуклеары, в лунках "Опыт" инкубируются мононуклеары в смеси с митогенами - ФГА,Кон-А, МЛ в оптимальных митогенных концентрациях, подбираемых к каждой серии митогена индивидуально. Планшеты инкубируют в течение 72 ч при 37.С в присутствии 5-ной С 02. Работа проводится в стерильных условиях, За 4 ч до окончания инкубирования в лунки планшет добавляютН-тимидин в дозе 1 мкк и в лунку, условия последующего инкубирования те же,По окончании инкубирования содержимое лунок осаждается 12-канальным собирателем фракций - харвестером на стекловолоконные фильтры с диаметром пор 2,5 мк, Уровень остаточной радиоактивности на фильтрах, обусловленный включением Н-тимидина в ядерные нуклеотидные последовательности трансформировавшихся лимфоцитов, просчитывается на счетчике Р-излучения в толуольном сцинтиляторе (0,2 Г РОРОР, 5 мг РРО на 1 л толуола),Результат реакции учитывается по трем параметрам: уровню включения изотопов в нестимулированные культуры (контроль), уровню включения изотопа в стимулированные мигогеном культуры (опыт) и индексу стимуляции (ИС), импlмин,опытх 100имп мин, контроль 00Способ имеет следующие недостатки, 1. евысокая точность, так как использование искусственно полученных стимуляторов - митогенов дает мощный стимул к пролиферации и секреторной активности лимфоцитов, что в ситуации и что не наблюдается, Уже через 20-.30 мин после до бавления митогена в мононуклеарную суспензию образуются огромные конгломераты клеток, хорошо наблюдаемые в инвертированном микроскопе, обусловленные агглютинирующим действием митогенов, И, как следствие, значительный разброс данных, достигающий несколько десятков тысяч имп/мин. 2. Длительный срок постановки реакции. С учетом получения окончательных результатов после 72 ч инкубирования - 96 ч.3. Кроме того, получаемые результаты митоген-обусловленной пролифераций не 10 всегда коррелируют с клиническим состоянием больного. В этом случае информативность способа сводится к минимуму.4. Механизм РБТЛ на митогены сводится к специфическому взаимодействию ФГА,межклеточных взаимодействий иммунокомпетентных клеток, которые обусловлены антигенамикласса гистосовместимости(НА-ОЯ, Н .А-ОР, Н .А-ОС), Между тем по 25 следнее обстоятельство имеет существенно большее значение при оценке иммунного статуса, нежели первое,5. Практическая неприемлемость способа при проведении иммуноэпидемиологиче 30 ских исследований, вследствие дороговизны способа, большой трудоемкости, полном отсутствии стандартизации иунификации его исполнения. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа,Поставленная цель достигается предлагаемым способом, включающим в себя инку 35 бирование мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, причем в качестве стимулятора используют культивируемую и чего клеточную линию Яа), предварительно обработанную 0,8-1,2 раствором параформальдегида при соотно- шении клетки Яа): мононуклеарные клетки равном 0,8-1,2,1, концентрации клеток 2-4 х х 10 /мл и инкубацию проводят в течение 48 - 50 ч,Клеточная линия Яа) обычно применяется для определенияколичества циркулирующих иммунных комплексов с использованием радиоиммунологического метода (3).Для тестирования РБТЛ на АГ к Йа эта линия не использовалась.Ниже приводится обоснование режи- способа.Использование параформальдегида а диапазоне 0,8-1,2 обусловлено тем, что оптимальный эффект при обработке клеток параформальдегидом с сохранением анти 40 45 50 леток мов. либо Кон-А с соответствующими клеточны 20 ми рецепторами и он не отражает той сферы45 50 55 имп/мин, опыт ИС где и вчи ются сред лельных лВ таб ные на 11Обсче тными мет слителе и,в знаменател ние арифметические т унок для каждого изме л.1 приведены данные здоровых донорах.т результатов проводил одами вариационной с е учитыварех паралрения,, получен и стандартатистики. генных мембранных детерминант и клеточной структурированности достигается именно в этом диапазоне, Снижение концентрации ниже 0,8 Д сопровождается существенной потерей фиксирующих свойств 5 параформальдегида, а увеличение этого процента выше 1,2; нежелательно, поскольку не повышает фиксирующего эффекта параформальдегида на клеточные мембраны. 10Обработка клеток Ва)3 параформальдегидом в диапазонных концентрациях блокируют их способность к пролиферации как в процессе культивирования, так и при действии стимуляторов, 15Это обстоятельство имеет большое значение, поскольку позволяет учитывать пролиферацию только мононуклеаров исследуемых лиц в предлагаемом способе,Соотношением - клетки Ва/1: мононук леарные клетки является диапазон 0,8 - 1,2;1, Отклонения в ту или иную сторону по количеству клеток Вар является нежелательным, поскольку нарушает сложившийся оптимум бластогенного ответа мононуклеаров 25 периферической крови, Изменения указанного соотношения сопровождаются вариацией клеточной плотности на дне платика и, соответственно, изменением бласттрансформации и пролиферации мононуклеаров, 30 а также секреции ими цитокинов, что сказывается на точности предлагаемого способа, Использование в предлагаемом способе клеточной концентрации 2-4 10 /мл обусвловлено следующими обстоятельствами, 35 При постановке контролей, которыми сопровождается каждая реакция, раскапывание чистой мононуклеарной суспензии в объеме 100 мкл и с концентрацией ниже 2 х х 10 /мл не создает достаточной плотности 40 клеток в лунках плоскодонных пластин для иммунологических реакций и межклеточные контакты, таким образом, сводятся к минимуму. В результате условия спонтанной РБТЛ становятся неоптимальными, что в свою очередь будет вносить существенную ошибку в конечный итог реакции,Увеличение же концЕнтрации выше 4 х х 106/мл сопровождается пропорциональным увеличением уровня включения Н-тиз мидина в контрольных лунках, что значительно изменяет результат реакции, вычисляемой по индексу стимуляции,То же самое относится и ко времени инкубации - 48 - 50 ч: увеличивая это время, мы тем самым увеличиваем уровень вкл 1 очения изотопа в контроле, а уменьшение времени ниже 48 ч нежелательно, поскольку оно будет недостаточным для запуска всех процессов РБТЛ в клеточной культуре,Конкретные примеры осуществления способа.П р и м е р 1. Периферическую гепаринизированную кровь в стерильных условиях разводят в соотношении 1:2 питательной средой 199 и наслаивают на градиент ВсоПРацое (д = 1,077 г/см ). Центрифугируют в режиме 300 д в течение 30 мин при 1 =20 С). По окончании центрифугирования собирают интерфазное кольцо, трижды отливают в среде 199 и составляют клеточную суспен-. зию в ППС известного. состава: среда ВРМЛ+ 10 ЭТС+ 2 мм глютамина+ буфер НЭПЭС 1 мл на 100 мл + гентамицин 80 мкг/мл в концентрации 2 10 /мл. Клетки6Вай (Сэтаоцце о 1 СеИ Опез, НуЬгЫогпаз.1985, АТСС, СС 86), культивируемые п нсго берут в реакции на 2-й день после пересева, когда они находятся в логарифмической фазе роста, отливают в ППС. составляют суспензию в концентрацией 2 10 /мл. Затем,6после центрифугирования и удаления надосадка, их помещают в 0,8 О/,-ный раствор параформальдегида на РВИ. Инкубируют 20 мин в холодильнике, По окончании инкубации трижды отмывают в РВЯ и ресуспендируют в ППС с тем, чтобы сохранилась упомянутая клеточная концентрация.В лунки плоскодонных пластин для иммунологических. реакций раскапывают по 100 мкл мононуклеаров исследуемых лиц и клетки Ва) в смеси(опыт, соотношение 1:1), а также чистые мононуклеары без клеток Вар (контроль), Общий объем реакционной смеси составляет 200 мкл. Каждую реакцию проводят в трех параллельных лунках, Плашки инкубируют при 37 С в присутствии 5,-ной СО 2 в течение 48 ч. За 4 ч до окончания культивирования в лунки добавляют 0,5 мкКи Н-тимидина и затем содержимоезлунок осаждается на фильтры 12-канальным собирателем фракций. Уровень остаточной радиоактивности на фильтрах фиксировали на счетчике Р-излучения (МагИ 1) в толуольном сцинтиляторе известного состава. Индекс стимуляции (ИС) просчитывали по формулеП р и м е р 2. Способ проводили анало- проведения реакции на 24 ч, Причем повыгично примеру 1 с той лишь разницей, что шение точности касается как абсолютногоклетки йа)1 обрабатывали 1,2 -ным пара- включения Н-тимидина в опытных лунках,формальдегиром, концентрация клеток со- так и вычисления индекса стимуляции,ставила 4 10 /мл, а инкубацию проводили 5 Ошибка опыта для первого и второго случа 50 ч, ев в РБТЛ на антигены клеток Ва 31Результаты представлены в табл.2. составляет, соответственно, 8,5 и 9,5 о , а вКак видно из таблиц, результаты незна- РБТЛ на ФГА - 17,8 и 19,6%, Повышениечительно отличаются один от другого, что точностипредлагаемогоспособадостигаетпозволяет сделать вывод о практической их 10 ся также за счет следующих элементов реидентичности. акции,П р и м е р 3. Последовательность ма- Снижение времени инкубирования донипуляции соответствует приведенной в 48 ч влечет за собой снижение уровня вклюпримере 1, при этом используют 0,8 о -ный чения изотопа в контрольных лунках (спонраствор параформальдегида, количество от танная бласттрансформация), этот уровеньвечающих мононуклеарных клеток - 2 х колеблется в пределах нескольких сот имх 106/мл, время инкубации -48 ч, количество пульсов в мин, что в свою очередь уменьшаклеток Яа 31 1,6 10 /мл, т.е. соотношение ет разброс этих данных и снижает ошибку6, клетки йа)1: мононуклеарные клетки состав- при вычислении индекса стимуляции.ляют 0,8:1, 20 Использование строго стандартизироРезультаты представлены в табл.З. ванной клеточной культуры позволяет в.П р и м е р 4, Способ осуществлялся опытных лункахсвести к минимуму разброс.аналогично приведенному в примере 1. данных, что также повышает точность споИспользуют 1,2 параформальдегида. соба, как при учете уровня абсолютногоКоличество отвечающих клеток - моно включения изотопа в опыте, так и при вычиснуклеаров 2 10 /мл, время инкубации - лении индекса стимуляции.650 ч, Все приведенные аргументы теряютКоличество клеток Яа)1 составило 2,4 х свою силу при проведении РБТЛ на ФГА,х 106/мл, т.е. соотношение Ва 31: мононукле- поскольку увеличение времени инкубирова. ары имеет вид 1,2;1, 30 ния до 72 часов пропорционально увеличиРезультаты представлены в табл,4. вает уровень включения изотопа вКак видно иэ представленных таблицах спонтанной бласттрансформации, а также вданных, результаты определения РБТЛ на опыте, когда клетки, получая мощный сти-.антигены клеток йа 31 варьируют в незначи- мул в виде ФГА, включают изотоп в десяткительных пределах при использовании соот тысяч имп/мин, а это. в свою очередь, увеношения клеток Вар: мононуклеары от 0,8:1 личивая разбросданных, резкоснижаетточ.до 1,2:1. Ошибка опыта колеблется от 8 до ность прототипа, как при учете абсолютного8,5% по иС, что не вносит сущест 1 енных уровня включения изотопа в опыте, так иизменений в точность способа и таким об- привычислениииндексастимуляции(таблираэом является допустимой при практиче ца йг 5),ском использовании способа, Предлагаемый способ был апробированДля сравнения способа по прототипу с в экспедиционных условиях при:проведепредлагаемым для подтверждения большей нии иммуноэпидемиологических исследоваточностипоследнегоисокращения времени ний на металлургическом комбинате впроведения реакций были проведены па Нижнем Тагиле. Проведенная работа покараллельные эксперименты РБТЛ на анти- зала полную пригодность способа в экспегены клеток Яа)1 и ФГА в митогенной дозе диционных условиях, результаты30 мкг/мл. тестирования РБТЛ на антигены клеток йа 11Условия проведения реакций отражены 24 рабочих комбината дали индекс стимуляв примере 1 и прототипе, Результаты пред .ции: ИС = 8+0,74.ставлены в табл.5, Проведены также исследования по опВ таблице представлены средняя ариф- ределению возможности сохранения антиметическая Ь ошибка средней арифмети- генных свойств клеток Йа 11 при длительномческой в, а также ошибка опыта Р = хранении. Дляэтого клетки извлекались изгп 55 культуры, обрабатывались 1-ным пара.формальдегидом и оставлялись на хранениеКак видно из приведенных данных. внемже при с:=4 С.Реэультатытестировапредлагаемый способ обладает большей ния РБТЛ на антигены клеток йа 11, хранивточностью (в =реднем в 2 раза) по сравне- шихся 2 месяца в указанном режиме.ниюс прототипом. дтакжесокращает время показали полное сохранение ими аниген10 1777085 Таблица 1 М - средняя арифметическая, О - стандартное отклонение, аедней, Р - ошибка опыта.Т а блица ных свойств, индекс стимуляции при тестировании на 5 донорах составил 40,8. Этот факт открывает возможность. заготовки и длительного хранения стимуляторов при проведении иммуноэнидемиологических исследований. Таким образом, предлагаемый способ определения РБТЛ на антигены клеток Ва) обладает, по сравнению с прототипом, большей точностью (в 2 раза), сокращением времени проведения реакции на 24 ч.Кроме того, предлагаемый способ позволяет строго стандартизировать условия проведения реакции, поскольку длительно пассируемая 1 и что культура Ва) обладает моноклональными свойствами, экспрессия мембранных АГ, на которые идет ответ, достигает стабильного уровня и обработка параформальдегидом фиксирует этот стабильный уровень,Полученные данные по длительному хранению клеток Ва открывают возможность выпуска стандартизированных препаратов Ва), что, учитывая скудость советского рынка, является немаловажным фактором в обогащении методического арсенала учреждения иммунологического проФиля.Формула изобретения Способ определения бластной трансформации лимфоцитов, включающий инкубирование мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, в качестве стимулятора используют клеточную линию Ва)1, обработаннуюю предварительно 0,8 - 1,2 О -ным раствором параформальдегида, при этом берут клетки Ваи мононуклеарные клетки в соотношении 0,8-1,2:1 и концентрации клеток 2 - 4 к 10 /мл, инкубацию проводят втечение 48 - 50 ч.612 1777085 Продолжение табл, 2 эблиц аблица 5 дакто евская хред М,Моргентал Корре кто За Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгоро гарина 10 4120 . Тираж Подписное ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5