Способ получения препарата из гипофизов животных для вызывания полиовуляции

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ СПУБЛИК 5 А 61 К 37/ ГОСУДАРСТВЕНЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯ ЕНИЯ ИДЕТЕЛЬСТВУ М К АВТО Изобретение отн зяйству, а именно к зн и может быть исполь по производству преп лиовуляцию, а 1 зкже ских учреждениях и о для исследовательскиЦель изобретени кости способа, искл ществ,зы измельчаютентрацией СаС 2 отеаэ из соевых Н доводится 2 н.пофиэов осуще- :2,0; масса/обье 24 С, с ительностью 2 ч. и осаждаются вуге(4 С, 100009,осится к селдокринологииовано на преаратов, выэыв научно-исслтдельных лах целей.я - снижениеючение токс скому хоживотных, дприятиях вающих по едовател- ьборатори трудоемчных веОПИСАНИЕ ИЗ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИЗ ГИПОФИЗОВ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ВЫЗЫВАНИЯ ПОЛИОВУЛЯЦИИ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к зндокринологии животных, и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию, а также в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей. Цель изобретения - снижение трудоемкости способа и исключение токсичных веществ, Для этого используют высокомолекулярный полиспецифический ингибитор иэ 1704786 А 1 соевых бобов в количестве 1 .г на 1 кг железы; СаС 1 до концентрации в среде 0,2 мМ и 2 М НаОН для формирования требуемых ионного состава, ионной силы и рН среды до 9,5 в целях создания оптимальных условий экстракции; используют ортофосфорную кислоту в смеси с другой минеральной или органической, например уксусной, кислотой для доведения рН среды до 3,5 и первичного фракционирования сульфатом аммония с последующим двукратным осаждением возрастающими концентрациями соли, растворением второго осадка, его диализом и лиофилизацией, Использование ингибитора из соевых бобов предотвращает губительное действие протеолиза на биологически активное начало препарата, исключается,из технологии применение токсичных и канцерогенных реагентов, ка. ковыми являются синтетические ингибиторы протеаэ. Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия и смеси ортофосфорной с другой органической или минеральной кислотой приводит к упрощению способа и сокращению времени получения препарата без снижения его биологической активности. 3 табл,Замороженные гипофи ся на холоде в среде с кон ц 0,05 мМ и ингибитором пр бобов 0,5 г на 1 кг железы, р йаОН до 8,0, Экстракция ги ствляется в этой же среде (1 ем) при температур перемешиванием продолж По истечении этого времен рефрежираторной центриф15 мин) нерастворившиеся компоненты железы, Надосадочная жидкость сохраняется. При необходимости можно проводить по. вторную экстракцию. 8 этом случае растворимые части объединяются.8 надосадочную жидкость добавляется (МН)2504 до концентрации 0,01 М, рН доводится до 3,5 холодной смесью приблизительно 10-ной ортофосфорной и приблизительно 207 ь-ной другой органической или минеральной кислоты, например уксусной, в соотношении 1,0:0,25, Через 20 мин проводится центрифугирование (при прежнем режиме). рН супернатанта доводится 2 н. ИаОН до 6,0 и добавляется серно- кислый аммоний до концентрации 1,70 М, оставляется на 2 ч при температуре 2-4 С для формирования осадка. По истечении этого времени смесь центрифугируется(при прежнем режиме). К супернатзнту добавляется сернокислый аммоний до концентрации 2,5 М. рН 6,0 (доводится 2 н, МаОН). Супернатант оставляется при температуре 2-40 С для формирования осадка, центрифугируется при прежнем режиме. Надосадочная жидкость отбрасывается. Осадок растворяется в минимальном количестве 0,2 М раствора двухзамещенного фосфорно- кислого калия. Раствор диализуется против воды в течение 12 ч при температуре 2-4 С.Образовавшийся во время диализа осадок отделяется центрифугированием (режим прежний). Прозрачная надосадочная жидкость, содержащая целевой продукт, лиофилизуется известным способом.Аналогичные этапы выделения целевого продукта проводят по вариантам 2 и 3 на средние значения параметров и варианту 4 нэ верхние значения параметров (см. табл.1).Испытана эффективность оптимальногв варианта предлагаемого способа выделения целевого препарата иэ гипофизов животных в сравнении с известным способом, Операции и режимы оптимального варианта приведены в табл.2:Способ выделения целевого продукта из гипофизов животных(вариант 3) позволяет получать препарат по биологическому теСту на неполовоэрелых крысах, не уступающий препарату, полученному известным способом (см. табл,З).Таким образом, при выделении целевого продукта замена синтетического ингибитора протеаз бензамидина на поливалентный природный ингибитор соевых бобов позволила исключить иэ технологии токсичный и канцерогенный реактив, В связи с этим предла 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 % гаемый способ исключил процедуры дозированного нагревания с последующим охлаждением и центрифугированием, в случае оптимального варианта снизил время дизлиза с 72 до 48 ч, Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия вместо свежеприготавливаемой гидро- окиси кальция исключило необходимость приготовления этого реактива. а также замена свежеприготавливаемой метафосфорной кислоты на смесь фосфорной с другой органической или минеральной кислотой, например уксусной, исключала необходимость приготовления метафосфорной кислоты, при изготовлении которой происходит выделение вредных продуктов, что приводит к исключению иэ технологии токсичных продуктов, упрощению метода, сокращению его по времени беэ снижения биологической активности,формула и зоб рете ни я Способ получения препарата иэ гипофиэов животных для вызывания 6 олиовуляции, включающий иэмельчение, двукратную экстракцию в щелочной среде, содержащий ингибитор протеаз, центрифугирование при 4 С, 10000 ц, в течение 15 мин, отделение и объединение надосадочных жидкостей, однократное осаждение сернокислым аммонием в кислой среде при рН 3,5, а затем двукратное при рН 6,0-8,0, центрифугирование, отделение и растворение осадка в 0,2 М двухзамещенном фосфорнокислом калии, диалиэ раствора, центрифугирование и лиофилизацию,отл ич э ющийся тем, что, с целью снижения трудоемкости способа и исключения токсичных веществ,в качестве ингибитора протеаэ в среде экстракции используют природный высокомолекулярный полиспецифический ингибитор иэ соевых бобов в количестве 0,5-1,5 г на 1 кг ткани железы с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,05-0,3 мМ и гидрата окиси натрия до рН 8,0-9,5, а при осаждении сернокислым аммонием рН доводят до 3,5 смесью 10-ной ортофосфорной и 20-ной уксусной кислот, взятых в соотношении 1:0,25-2,0, причем насыщают надосадочную жидкость сернокислым аммонием до 0,01-0.30 м, выдерживают в течение 20-50 мин, а после повторного и третьего осаждения сернокислым аммонием выдерживают 1-24 ч и диалиэ раствора проводят в течение 12-72 ч вслед эа растворением осадка в двухэамещенном фосфорнокислом калии с последующей лиофилизацией отдиалиэованного растворапрепарата.1704786 Т а б л и ц а 1 г ьгиаыи Операции Варианты способа.,Этап На холоде Иэмельчение 1:2)0 1:2)5 1:3)0 1:4,0 0,75 1 0)5 0,05 0)15 0)20 О) 306)0 8,5 9,0 9,52,0 2,5 3,0 4,5, рН время, ч 4 С, 10000, 15 мин 1 з 1)5 12)0 1 й 2)0 12)5 0,30 0,10 0,20 0,01 1; 0,2520 1 ф 2 1:0,5 1:130 40 ноаениевремя, мин прежний В надосадочиую жидкостьвносят сухой (КБ) 80 ф доконечной концентрации, Н 1 7 6,0 2 время, ч прежний Экстракция: соотноцаниеткани, и средыСодермание ингибитораг/кг ткани СаС 1 до концентрации,мМ Центрифугирование (температура, К) время) Повторная экстракцияпреципитата в прежнейсреде: соотновениеткани исреды Центрифугирование, режим В объединенную надоса дочную жидкость добавляют сухой Оф)фВЪ до концентрации, И рН доводят смесью10-ной ортофосфорнойи 20-ной уксусной кислот) до рН 3,5, соотЦентрифугирование,режим Кентрифугирование,режим 1 756,55 1,87,510 1,358,041704786 Продолжение табл. 111 1 е в Г 1 2 ююЪ ав еьве (Ь. 10 рН время, ч Центрифугирование,режим прежнийо 6 ьем минимальныйю 12 Осадок растворяют в0,2 М КНРО Диализ против воды,время, ч 12 Центрифугирование,режим прежний" Лиофилизация надосадочной жидкости йзвестнымспособом е е еП р и м е ч а н и е. Все процедуры проводятся при температуре2-4 С. Наивысшая активность препарата побиологическому тесту вариант 3 (табл.3). Таблица 2 ю ееевеееевеееааеаееевве Способ Этап Операции ееюеевмаеаевееюаеаеюаеееваее известный предлагаемый на холоде/2 Иэмельчение а холоде Экстракция: соотношение ткани и среды свежеприготавливаемый Са(ОН)у,10 ингибитора) бензамидин, мМ 5,0 б) соевый, г/кг тка" ни железы 1,00,20до рН 9,03,0 3,0 4 С, 10000, 15 мин В надосадочную жидкостьдобавляют сухой (НН)БОдо конечной концентрации, М СаС 1 а, М 2 н, НаОН время, ч Центрифугирование, (температура В время) 2,56,02 2,36,55 3,0У,510 358,0241704786 10 Прололжение табл, 2 Г 3 1 4 Вторичная экстракцияпреципитата (средапрежняя) допустима допустима соотношение ткани исреды 1:3 13 2,0 1 е 2 время, ч прежний прежнийВ обьединенную надосадочную жидкостьвводят сухой (МН ) БОконцентрация, Ндо рН 3,5доводят: 0,15 40 время, мин Центрифугирование,режим прежний прежний В надосадочную жидкость вносят сухой (ЙНд) ВО до конечной концентрации, Н 1,8 7,524 рН время, ч Центрифугирование,режим прежний прежний 10 В надосадочную жидкость вносят сухой (МН 4)ЯО до конечной концентрации, Н 3,0 7,Р24 рН время, ч прежний прежний обьем ми- минимальныйнимальный Термообработка, температура, С 2-3 охлаждение г гаее мг г 2 Цент рифугированне,режим Центрифугирование,режимРастворение осадка в 0,2 М КНР 04 время, минохлаждение до 4 С6 свежеприготавливаемойметафосфорной кислотой, 0,2"0,5 Нне более 40 0,20смесью 10-ной ортофосфорной и 20-ной уксусной кислотой (1: 1) 1,87,510 3,07,51012Продопл;ение табл.1 1704786 14 Центрифугирование, режим прежний прежний Диализ раствора против воды, чЦентрифугирование,режим 48 72 16 прежний прежний известный известный 1 У Лиофилизация, способ МП р и м е ч а н и е. Все продукты ведут при температуре 2-4 С,конечный продукт представляет собой лиофилизованный препарат. ТаблицаЗ Составитель А.филипповаТехред М,Моргентал Корректор М,Максимишинец Редактор Т.Смирнова Заказ 143 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Активность препаратов, приготовленных по известному и различным вариантам предлагаемого способа