Способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 177 А 6 7/00 // А 01 ЕН ь изобретения: по- растения аналиэиние эеатина и пнительно аналиэирастения на содернов. Как устойчивые которых увеличивана и зеатин-рибозискии о оцен 7 - 12. ВОСТ реждение и как т растения. у кототсутствует изменекининов. 2 табл., 2 иохимия ений на ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Методические рекомендации иустойчивости зерновых колосовых квредителям. М, ВАСХНИЛ, 1988, с(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИКУКУРУЗЫ К ЗЛАКОВЫМ ТЛЯМ(57) Использование: физиология и брастений, спссобы селекции раст Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть использовано в области селекции растений на устойчивость. Известен способ устойчивости кукурузы к стебпевому мотыльку, основанный на определении концентраций соединений вторичного метаболизма 6-метоксибензоксазолинонов в листьях взрослых растений, он требует использования малоинформативного и трудоемкого метода бумажной хроматографии и применения 2%-ного хлорного железа. Определение проводится на основании визуальной оценки размера и интенсивности свечения хроматографических пятен на хроматограммах, полученных из вытяжек сортов кукурузы с известной и неизвестной степенью устойчивости, оцениваемой в баллах. Метод связан с применением хроматографии на бумаге, занимающей, как правило, от 10 до 48 ч. Кроме того, данный метод обладает низкой эффективностью разделения и не позволяет проводи 1 ь количественного анализа исследуемых соединений, Известен споустойчивость, Сущност врежденные вредители руют на содержа зеатин-рибозида. Допо руют неповрежденные кание тех же цитокини оценивают растения, у ется содержание зеати да в ответ на пов неустойчивые оцениваю рых уменьшается или ние в содержании цито соб. основанный также на определени концентраций циклических гидроксаматов (ДИМБОА и МБОА) в растениях кукурузы, связанный с использованием фотометрии Этот способ, взятый за прототип, трудоемок и малоэффективен. так как требует большого количества материала, большой подготовительной работы (более суток). а также не позволяет выявить физиологических барьеров устойчивости кукурузы к вре.дителям. Кроме указанных недостатков фотометрический метод определения не селективен для анализируемых соединений по причине присутствия большого количества примесей, содержащихся в растите ьных экстрактах. искажающих результаты ачапи.эа. Следует также отметить. что данные методы были разработаны для оценки степени устойчивости кукурузы к стебпевому мотыльку, Предлагаемый способ преднаэ ачен для оценки степени устойчивости кукурузы к другому вредителю - элаковой тле, 1779302Целью изобретения является возможность определения устойчивости кукурузы к злаковым тлям и повышение точности анализа на основании регистрации изменений содержания природных фитогормонов цитокининов в неповрежденных и поврежденных вредителями растительных тканях методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Поставленная цель достигается тем, что анализируются листья контрастных по устойчивости линий кукурузы, поврежденной и неповрежденной тлями, с помощью метода ВЭЖХ. Критерием устойчивости служит степень изменения эндогенного уровня цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида) в листьях контрастных по.устойчивости линий кукурузы, подвергнутых воздействию вредителей, Других аналогов с подобными признаками не обнаружено, Зеатин и зеатин-рибозид, являющиеся растительными гормонами., в качестве биохимического показателя устойчивости ранее не использовались. По сравнению с прототипом предлагаемый способ наряду с меньшей трудоемкостью и большей экономичностью обладает более широкой информативностью, позволяющей проводить не только качественную, но и количественную оценку содержания анализируемых соединений, Количественное определение эндогенных цитокининов, выполненное методом ВЭЖХ, отличается высокой воспроизводимостью и требует небольшого времени для анализа (от 10 до 20 мин на одну пробу), Подготовительные процедуры экстракция, фильтрация и фракционирование, необходимые для приготовления 30 проб, занимают один рабочий день, Анализ образцов можно проводить в любое время года, так как используемый материал может храниться в эксикаторах в сухом виде несколько лет, Подсчет концентраций соединений проводится автоматически с использованием интегратора, что позволяет проводить точную количественную оценку содержания анализируемых веществ, а не ограничиваться качественным содержанием цитокининов, Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом служит точная качественная и количественная оценка содержания зеатина и зеатин-рибозида, которые. как известно, являются маркерами физиологического состояния растений. Способ, описанный в прототипе, основан на определении в растительных тканях циклических гидроксаматов, которые, в отличие от фито- гормонов, обладают не реулятарными, а узко антибиотическими свойствами,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является то, что он позволяет в быстрый срок определить ответную реакцию кукурузы на повреждение ее сосущими вредителями, которая выражается в неадекватном ответе различных по устойчивости линиях растений на изменение эндогенного уровня зеатина и зеатин-рибозида, Последнее отражает физиологическое состояние растения по аналогии с изменениями гормонального уровня животных клеток, подвергнутых неблагоприятным воздействием, Использование метода ВЭЖХ позволяетанализировать небольшие количества растительного материала: 50 - 200 мг сухого веса ткани.Сущность предложенного способа заключается в том, что для оценки образцов кукурузы используются спиртовые экстракты, полученные либо из лиофильно высушенных, либо иэ свежих листьев кукурузы, которые фиксируются и экстрагируются спиртом, Полученные экстракты упариваются до водной фазы, а затем подщелачивали 1 н, КОН до рН 8 и экстрагировали н-бутанолом, который упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в смеси ацетонитрила и воды и вводили в хроматограф, После хроматографического анализа подводили подсчет концентраций полученных пиов по следующей формуле:51 С 2 Ч 2Б 2 1 Ргде С 1 - концентрация анализируемого вещества в пробе, мкгlг;С 2 - концентрация стандартного вещества(синтетического зеатина или зеатин-рибоэида) в аликвоте пробы,мкг;51. - площадь пика анализируемого вещества, мм;52 - площадь пика стандартного вещества (зеатина или зеатин-рибозида), мм;Ч 1 - общий обьем пробы, м кл;Ч 2 - обьем аликвоты пробы, мкл;Р - навеска, г,Анализ проводился в 3-кратной повторности.Критерием устойчивости линии служит увеличение концентрации зеатина или зеатин-рибозида в тканях при их повреждении тлями, критерием неустойчивости - снижение содержания этих веществ. Достоверность увеличения или снижения содержания цитокининов доказывается с использованием однофакторного дисперси. онного анализа,П р и м е р 1, Для анализа цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида) используются апикальные листья устойчивой линии куку.40 45 50 рузы А, поврежденные и неповрежденные злаковыми тлями. Нагрузка оценивалась в баллах по стандартной методике. Балл повреждения составлял 4. Листья лиофильно высушивали, взвешивали, брали 50 г и экстрагировали этиловым спиртом; экстракты упаривали до водной фазы, подщелачивали 1 н. КОН до рН 8 и экстрагировали н-бутанолом, который упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 3 мл смеси ацетонитрила и воды (1:); часть которой (20 мкл) вводили в хроматограф модели НРР - 5001 (ЧССР). Анализ проводили при следующих условиях: скорость потока жидкой фазы (ацетонитрила, воды и уксусной кислоты в соотношении 55-44-1) 1 мл/мин, среднее давление 70 бар, Режим изократический, Применяли колонки фирмы "Яегна" размером 4,6 х 250 мм, заполненные твердым носителем Ос 1 асесу=-Я 100 Роуо с размером частиц 5 мкм, а также колонки производства ЧССР типа Сразмером 4,6 х 150 мм. заполненные твердым носителем ЯОХ Яерагоп размером 3 мкм. Детектирование проводили в УФ-свете при длине волны А = 254 нм. Объем вводимой в хроматограф пробь 1 20 мкл. Калибровочные растворы синтетических зеатинэ и зеатин-рибозида, необходимые для калибровки прибора, содержали 0,1; 0,2; 0,5 мкг/аликвоте, Подсчет концентраций исследуемых соединений проводили на основании вычисления площадей пиков и коэффициентов разбавления, Обработку полученных данных проводили, подсчитывая среднюю арифметическую (х), ошибку средней (Ях), стандартное отклонение (Ях), достоверность средней (сх), вариабельность (1/), Затем проводили однофакторный дисперсионный анализ для доказательства того, что воздействие сосущих вредителей на кукурузу достоверно влияет на изменение содержания цитокининов в листьях (при р0,01).П р и м е р 2. Тоже, что и в примере 1.Берут 50 мг сухого растительного материала (высушенные лиофильно апикальные листья) неустойчивой линии ЮГ, поврежденного и неповрежденного злаковыми тлями. Балл повреждения 4. Фиксацию, экстракцию, фракционирование, последующие этапы очистки экстракта и хроматографический анализ с помощью ВЭЖХ проводится аналогично примеру 1. 5 10 15 20 25 30 35 Критерием неустойчивости линии служит уменьшение или отсутствие изменений в содержании цитокининов (зеатина, зеатин-рибозида) в тканях при их повреждении вредителем. Достоверность доказывается, как и в примере 1, с помощью однофакторного дисперсионного анализа, На фиг. 1 приведенные данные по содержанию эндогенных цитокининов: зеатин-рибозида и зеатина в контрольных 1 и 2 и поврежденных 3 и 4 тлями листьях кукурузы (в мкг/г сухого веса ткани). В табл, 1 приведены данные по изменению содержания зеатина и зеатинрибозида, а также их суммы в различных по устойчивости линиях кукурузы при повреждении ее тлями (в % по отношению к контролю). На фиг, 2 представлены данные по изменению суммы эндогенных цитокининов зеатин-рибозида и зеатина в поврежденных злаковыми тлями апикальных листьях кукурузы устойчивых (А - 619, 2039 А - 14 АУ, Р)и неустойчивых Ю, В/Е - 117, МБ - 385 линий (в %), Полевой способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям приурочен к определенному периоду вегетации растений и является достаточно трудоемким в силу специфики проведения энтомологических экспериментов, требующих оцень много времени для оценки устойчивости образцов, Предлагаемый способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям принципиально отличается от указанного выше способа не только более точным критерием устойчивости, но и независимым от сезона ходом выполнения анализа. Формула изобретения Способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям, включающий анализ растений. поврежденных вредителем, о т л и ч аю щ и й с я тем, что. с целью упрощения способа и повышения его точности, растения анализируют на содержание зеатина и зеатин-рибозида, дополнительно анализируют неповрежденные растения на содержание тех же цитокининов и как устойчивые оценивают растения, у которых увеличивается содержание зеатина и зеатин-рибозида в ответ на повреждение, а как неустойчивые оценивают растения, у которых уменьшается или отсутствует изменение в содержании цитокининов.1779302люП р и м и ч а н и я: В устойчивых формах кукурузы при повреждении тлями происходит величение содержания суммы цитокининов на 39,6 - 124,6 О по отношению к контролю, в еустойчивых -снижение на 8,4 - 35,6 О. ЮГ/ 8001779302 Составитель Е,КислинТехред М.Моргентал Редактор Л.Волкова Корректор Н.Милюков т",г.ужгород,ул Гагарина.101 зводственно-издательский комбинат" Па з 4398ВНИИП Тиражсударственного комитета по113035, Москва, ЖПодписноеобретениям и открытиям при ГКНТ ССаушская наб 4/5