Способ оценки содержания белка в семенах зерновых и зернобобовых культур

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИН С 01 Х 21/75 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЛЬСТВУ ВТОРСНОМУ СВИ(56) Рядчиков В. Г. Убелков и их оценка.Овчаров К. Е. Физиния и прорастания сем 37скохозяйственунзеИ. Х. Киртока лучшение зерновых М,: Колос, 1987. ология формироваян. М., 1966.ДЕРЖАНИЯ БЕЛКА ЗЕРНОБОБОВЫХ вой совокупносов, включающейе материала дл и методичес-.использование годаря нких приемв качестсперма нков, эксствлениестрого обранных нализа эндоценке ных проростом и осущестадии 3-4-днакцию его спирингидриновой еакции вциально подопе деленных словиях. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СОВ СЕМЕНАХ ЗЕРНОВЫХ ИКУЛЬТУР(57) Изобретение относится к биохимиирастений и может быть, использовано вработах по генетике и селекции зерновых и зернобобовых культур при оценкекачества семенного материала. Цельюизобретения является повышение чувствительности анализа и обеспечение возможности сохранения жизнеспособностипроанализированного материала. Основыпредложенного способа оценки содержания белка составляет новая совокупИзобретение относится к биохимии растений и может быть использовано в работах по генетике и селекции зерновых и зернобобовых культур при о качества семенного материала.Целью изобретения является повышение чувствительности анализа и обеспе чение возможности сохранения жизнеспо собности,проанализированного материала. 801597700 2ность методических приемов, включающая использование в качестве материала для анализа эндосперма зерна на стадии 3-4 дневных проростков, экст-: ракцию его спиртом и осуществление нингидриновой реакции в оптимальных для развития окраски условиях. Укаэанная совокупность приемов позволяет. сократить количество эндосперма, необходимое для проведения анализа до навески 20-40 мг, отбор которой из проросшего семени не сказывается на его жизнеспособности. При этом результаты оценки содержания белка в зерновых и зернобобовых культурах новым . способом четко коррелируют. с даннымиФ аналогичных исследований, проведенных традиционными методами, не предусматривающими возможность последующего использования проаналиэированных се- С мян для получения урожая, Применение изобретения в практике селекционных работ позволит обеспечить надежный отВйф бор высокобелковых семян без дополнительной затраты на анализ ценного посевного материала. 5 табл. оставленная цель достигается блПредложенная совокупность приемовпозволяет сократить количество эндосперма, необходимое для проведенияанализа, до 20-40 мг, т,е. до количества, отбор которого из проросшегосемени не сказывается на жизнеспособности проростка. Такие проростки после определения содержания белка могутбыть использованы для получения уро Ожая.Известные способы с применениемнингидринового окрашивания не позволяют провести четкую оценку степени"белковости" семян при использованииколичества эндосперма, достаточныхдля анализа предлагаемым способом.Результаты оценки содержания белкав. зерновых и зернобобовых предложенным и известным способами приведеныв табл. 1.П р и м е р 1. В качестве объекта используют семена кукурузы ВИР,ВИР, сои Кишиневская 16 и Кировоградская 3. Семена высаживают в чашки 25Петри и проращивают в течение 3-4 дн.Затем при помощи стеклячной трубки сзаостренным концом и нанесенной снаружи шкалой для определения объемаотбирают часть эндосперма и помещаютее в пробирку, добавляют 3 мл 80-70%ного этанола и 1,5 мл 0,3-0,6 -ногораствора нингидрина в ацетоне. Смесьнагревают до кипения, охлаждают и вы-"держивают при комнатной температуре40 мин.Интенсивность полученной фиолетовой окраски сопоставляют с интенсивностью окраски эталона либо визуально, либо после измерения на ФЭКе.Результаты исследования влиянияотобранного количества эндосперма наинтенсивность окрашивания и жизнеспособность семян после анализа приведены в табл. 2. 45П р и м е р 2. Оценку содержаниябелка проводят как в примере 1, заисключением того, что во всех пробахиспользуют 30 мг эндосперма, а коли- .чество этанола для экстракции,варьируют от 1,0 до 4,0 мл,Результаты, иллюстрирующие зависимость интенсивности окрашивания отиспользуемого для экстракции объемаспирта, приведены в табл, 3.55П р и м е р 3, Определение содержания белка проводят как в приме ре 1, за исключением того, что во всех пробах используют 30 мг эндосперма, аколичество добавляемого 0,3-0,6/-ногораствора нингидрина в ацетоне варьируют от 0,5 до 2,5 мл,Результаты, демонстрирующие влияние конечной концентрации нннгидринав пробе на интенсивность окрашивания,представлены в табл. 4П р и м е р 4. Определение содержания белка в эндосперме проросших семян проводят по примеру 1, однако вовсех пробах используют объем образца30 мг, а время выдержки после охлаждения варьируют от 20 до 60 мин.Зависимость интенсивности окраши-вания от времени приведена в табл. 5,Из представленных экспериментальных данных следует, что благодаря использованию семенного материала, обо-. гащенного частично гидролизованным белком (семян и зерновых после проращивания),. а также за счет подбора оптимальных условий для пр оведения цветной реакции (табл. 2-5) достигается более высокая интенсивность окрашивания материала., чем в известных методах с применением нингидриновой реакции. Это, в свою очередь, создает надежную основу для повышения чувствительности анализа и обеспечивает воз можность работы с малыми количествами эндосперма, отбор которых из проросшего семени не отражается на его жизнеспособности (табл. 2).Применение изобретения в практике селекционных работ позволит обеспечить надежный отбор высокобелковых семян без дополнительной затраты на анализ ценного семенного материала.Формула изобретенияСпособ оценки содержания белка в семенах зерновых и зернобобовых культур, включающий экстракцию семенного материала, ббработку экстракта нингидриновым реактивом с последующим кипячением и охлаждением реакционной смеси и сравнение интенсивности окраски раствора с эталонными образцами, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа и обеспечения возможности сохранения жизнеспособности проанализированного материала, экстракции подвергают пробу эндосперма пророщенных семян в ко1597700 рации нингидрина 0,060-0,24 Х, апослекипячения и охлаждения пробу выдерживают при комнатной температуре 30 -45 мин. личестве 20-40 мг, экстрагируют ее в 2,5-3,5 мл 70-80 Х-ного этанола нингидриновый реактив добавляют в виде раствора в ацетоне до конечной концент 5 Таблица 1 одержани елка в п оэффициорреляпрото,11 ,09 ,21 О,о,16,4 17 ф б ловия Количество эндосперма, мг 0040 Оэ 030 0,056 0,043 0,084 0,064 0,114 0,085 0,142 0,106 5 0,26 0,39 0,52 0,65 30 40 50 Количество этано-.ла, мл оличествоина, мл нгид 5 ремя выдержки ратворов проб, мин а б л и ц а лови оличество этана, мл 00,04 Количество эндсперма, мг 0 Количество нингидина, мл емя выдержк створа и Сорт кукурузы Содержа белка в1597700 Таблица 4 Интенсивность окраски растворов атели куруза Соя КиРшиневская 16 Соя Кировоградская 3 0,02 0,5,27) Колич ма, м тво эндоспер Количество этан а,аремя вьщер творов, ми 4 5 б л Время выдержки растворов, мин 2 3 2 0 К ество эндосперг 0 м личество этанола,Количество нингидрина, мл Составитель О. Скуратовская Шандор Техред Л.Олийнык Корректор Т. Малецедактор Заказ 3048 Тираж 511 П ВНИИПИ Государственного комитета по иэобрет113035, Москва, Ж, Раушс писное Ри ГКНТ СССР ниям и открытия ая наб., д, 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина Количество нингидри в ацетоне, мл и его конечная концентра 1,5 (0,1-0, 2) 2;0