Способ определения количества живых клеток в биопрепаратах

(51)5 С 1 ОСУДАРСТВЕННЫЙО ИЗОБРЕТЕНИЯМРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯМ ТЕ Е ИЗОБР ИСА ВТОРСКО ВИДЕТЕЛ ЬСТ,Од Ж 3 вввВ к прикладнойпособам аналиИзомикробиа микроКаклеток в ретение относитологии, а именно корганизмов.известно, для опрбиопрепаратах п методы, какление колиниювнутриклетструктурнь ысев на чашках ства живых кле держания ных компонент компонентов кл Петриок и,опредео измене- различных в (ферментов, еточной мембделения живых рименяют такие(71) Всесоюзный научно-исследовательскийинститут особо чистых биопрепаратов(56) 1. Методы общей бактериологии, Подред, Ф.Герхарда. - М.; Мир, 1983, т. 1, с,450-464.2. Са 1 сотт, Масеоб В.А, ТЬе ацгч 1 га о 1Е,соОгоп 1 Фгеелейачч багпаце: реггпеаЬ 111 туВагг 1 ег баааде апб чаЫ 1 туСап.,),МсгоЬ 1 о 1., 1975, ч.21, р.1724-1732.3. Ятгапце В,Р. пбцсеб епугпе зуптЬез 1 з1 п арнеоиз зцзрепз 1 опз о 1 зтогеб златопагуревазе аегоЬастег аегодепез - Катцге,1.опбоп, 1961, ч, 191, р. 1272-1273,4. Авторское свидетельство СССРМ. 857262,кл. С 12 й 1/00, 1979,5. Авторское свидетельство СССРМ 1458389,кл. С 12 К 1/00, 1986.6. Духин С.С. и Дерягин Б,В. Электрофорез. - М.: Наука, 1976, 328 с.7, Фридрихсберг Д.А. Курс коллоиднойхимии. - Л.: Химия, 1974, 352 с,8, Работнова Н,Л, Физиологическая изменчивость микроорганизмов и ее регулирование, - Успехи микробиологии, 1975,т.10, с. 120-131. 9, Тимаков В,Д, и Гольдфарб Д,М, Успе-,хи экспериментальной медицинской бактериологии, - М.: Медгиз 1958, 348 с.10, Кульский Л.А., Дейнека Д.Ф., Ульберг Э.РСавчук О.СМарочко Л,Г. и Демьяненко А,П, Электроповерхностныесвойства микробиологических объектов врастворах электролитов. - Коллоид. ж.,1980, т. 42. М 4, с. 755-758.11. Гузев В,С, и Звягинцев Д.Г. Электрокинетические свойства клеток микроорганизмов и их систематика, - Микробиол1973, т.42, М 6, с. 708-711.12, Нагбеп Ч.Р, апб Нагг 1 з,1,0. ТЬе1 зоеестг 1 с ро 1 пт о 1 Ьастег 1 а се 1.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИВЫХ КЛЕТОК В БИОПРЕПАРАТАХ(57) Использование: микробиологическаяпромышленность. Сущность изобретения:определяют дзета-потенциал нативной иполностью инактивированной культур.Строят кривую зависимости числа живыхклеток от величины дзета-потенциала. Определяют количество живых клеток по кривой,При этом сокращается время и повышаетсяточность определения. 2 табл. 2 фиг, 1735357раны, концентрации калия в надосадочной жидкости), появляющихся в среде после гибели клетки и т,д. 1-4.Недостатками известных способов являются низкая точность, необходимость сложной аппаратуры и длительность определений.Наиболее близким к предлагаемому способу является физико-химический метод 5, заключающийся в том, что точность и достоверность определения жизнеспособности микробных клеток повышается за счет стабилизации условий роста колоний. Уравнивание условий их образования одиночными клетками достигается тем, что плотные питательные среды, на которые наносятся для высева суспензии микроорганизмов, заземляют, что обеспечивает снятие возникающего при распределении влаги между пробой и средой электрического заряда. В качестве анализируемого параметра берется колон иеобразующая способность. Точность метода составляет приблизительно 300.Недостатком прототипа является длительностьь эксперимента (16-48 ч),Целью изобретения является разработка способа анализа, превосходящего по точности прототип и отличающегося меньшей длительностью.Указанная цель достигается тем, что в качестве параметра, определяющего состояние клетки, измеряют электрокинетические потенциалы.Анализ проводят следующим образом, Определяют дзета-потенциалы нативной ( р) и полностью инактивированной культур(рм ) и определяют число живых клеток по предварительно построенной кривой зависимости числа живых клеток от параметрав:ф-,где Ьр - разность дзета-потенциалов нативной культуры в момент времени 1(р) и полностью инактивированной культуры (рм )Лр 0 = Лр при 1=0,Определение дзета-потенциала клеток проводят методом микроэлектрофореза 6, Суспензию клеток помещают в видоизмененную ячейку Абрамсона, представляющую собой плоскопараллельный капилляр, на концах которого находятся емкости с обратимыми С 0=СоЯОа-электродами и агаровыми пробками. Наблюдение за движением клетки ведут с помощью микрОскопа "Биолар" (увеличение 300) в темном поле, Для определения истинной электрофоретиче 35 40 45 личия между этими потенциалами с их выживаемостью,П р и м е р 1. Культура Е.со 11 штамм М,выращенная на глюкозоминеральной среде, инактивировалась в результате хране 50 ния, Хранение осуществлялось при 20 + 2 и4 + 1 С в течение 16 сут. На разных этапаххранения одновременно с измерением дзета-.потенциала определялась их биологическая концентрация, В табл, 1 приведены55 усредненные значения исследованных параметров для биологических и физико-химических свойств клеток,По методу наименьших квадратов былпроведен расчет коэффициентов уравнения60 линейной регрессии, при этом были исполь 5 10 15 20 25 30 ской скорости клеток все измерения проводят на 1/5 глубины ячейки 6. Время (1) прохождения клеткой определенного расстояния (Ь) под действием постоянного электрического поля измеряют электронным секундомером СТЦ, после чего переключателем меняют направление тока на противоположное и снова фиксируют время. Такие измерения проводятся не менее чем для 100 клеток. Напряжение на ячейку подается с помощью блока питания УИПтак, чтобы градиент электрического поля составлял 600-700 В/м. Величину тока и напряжение в цепи регистрируют цифровым вольтамперметром ВК-20, а электропроводность суспензии измеряют по обычной методике на переменном токе в специальной ячейке с платиновыми электродами с помощью моста емкостей Е 8-2, Дзета-потенциал клеток рассчитывают по формуле Гельмгольца-Смолуховского 74 шк 1 Я 1)Отгде ц- вязкость раствора;к - удельная электропроводность суспензии клеток;Я - площадь поперечного сечения ячейки;О - диэлектрическая постоянная среды; 1 - сила тока в ячейке;Ь - расстояние, проходимое клеткой за время т,Измерения электрофоретической подвижности использовались ранее для определения видовой принадлежности микроорганизмов 8 и 9 и определения ихэлектроповерхностн ых свойств 10-13. Существенность отличий предлагаемого способа от известных заключается в том, что авторами впервые было установлено наличие разницы в дзета-потенциале между живыми и мертвыми культурами и связь раз1735357 50 55 зованы экспериментальные значения, приведенные в табл, 1 (БКсх 10, -р), Анализ полученных результатов показывает, что между выживаемостью и величиной дзетапотенциалов клеток существует линейная зависимость с коэффициентом корреляции 0,996. Коэффициент корреляции рассчитывался по формуле Тг-Х БК - БК Г , (, ) ) ( ) ( БК - БК )2 где Т - коэффициент корреляции;БК и , - средние значения соответствующих величин.Выявленная линейная корреляция между дзета-потенциалом и Б К и редстаеляет не только научный, но и практический интерес, поскольку на основании данных по электрофоретической подвижности клеток появляется возможность оценивать их биологическую активность. Учитывая простоту и большую скорость измерения, метод микроэлектрофореза в ряде случаев может заменить более трудоемкий традиционный способ определения биологической концентрации клеток - высев на твердые питательные среды и подсчет колониеобразующих единиц.П р и м е р 2. Из данных табл. 1 строится калибровочный график БКс/БКо от 0(см. фиг. 1). Этот график может быть использован для определения БК по измерению дзета-потенциала клеток. Например, дзета-потенциал и БК нативной культуры составляют 25,4 мВ и 8 х 10 кл/мл соответственно. Через 5 дней хранения дзета-потенциал клеток стал равен 15,5 мВ, Зная, что дзета-потенциал полностью инактивированной культуры составляет 10,5 мВ, вычисляем коэффициент 0=(15,5 - 10,5)х(25,4 - 10,5) - 1=0,3, Из калибровки определяем, что БК в результате пятидневного хранения культуры составляет 2,7 х 10 кл/мл, Традиционный способ - высев клеток на чашке Петри - дал значение 2,4 х 10 кл/мл, Резуль 9таты определения БК, полученные двумя способами, дают совпадающие в пределахэкспериментальных погрешностей величины, но в отличие от традиционного методаэкспресс-анализ позволяет определять БК5 клеток по электрофоретической подвижности в течение 10-20 мин,П р и м е р 3, В табл, 2 приведенызначения дзета-потенциала и БК культурыЕ,соП штамм М, подвергшейся разным10 режимам инактивации,Как видно из табл, 2, выживаемость клеток Е,соП, определенная двумя методами,дает близкие результаты,Из преимуществ метода можно указать15 также точность определения изменения БКклеток, полученной по электрокинетическо му потенциалу.П р и м е р 4. На фиг. 2 представленграфик зависимости БК от дзета-потенциа 20 ла для клеток Е,соИ М. На этой же фиг.2приведены среднеквадратичные отклонения полученных экспериментальных результатов. Измерения проводились по мереинактивации культуры в результате хране 25 ния при 4 и 20 С, Величина дзета-потенциала клеток определялась по измерениюэлектрофоретической подвижности не менее 100 клеток, Точность определения величины дзета-потенциала клеток Е,со30 соответствовала 3;ь. Численные значенияБК клеток определялись высевом клеток в4-5 чашках Петри, Как показали измерения,точность определения изменения выживаемости, вычисленной по дзета-потенциалу,35 превосходила точность определения изменения БК по традиционному методу в несколько раз.ф о р мул а и зоб р ете нияСпособ определения количества живых40 клеток в биопрепаратах путемизмеренияфизико-химического параметра исследуемой нативной и инактивированной культурс последующей оценкой результатов; от л ич а ю щ и й с я тем, что; о целью усКорения45 и повышения точности способа, в качествефизико-химического параметра измеряютдзета-потенциал.1735357 Таблица 1 Изменение физико-химических и биологических свойств клеток Е,со 1 в процессе хранения культурыПри расчете параметра О, величинличины дзета-потенциал клеток не опус инималась равной 10 т.к, ниже этои лиц зменение физико-химических и биологических ойств клеток Е.со в зависимости от способа инактивации10 1735357 5 70 бО Редактор М, Кузнецов орректор С, Черн аказ 1792 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035,Москва,Ж, Раушская наб., 4/5