Способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами

., Клибанование фосфов системеганическая673. АЛ. и др. Коипидов с белобращенных химия, 1988,Це ние про рованн повыш личени верхн антиге ью изобретения яв цесса получения ли ых с бактериальным ние качества препа эпитопной плотно сти липосом пр ных свойств белков ляется упрощепосом, коньюгии антигенами, и рата за счет увести белка на пои сохранении ых антигенов. состоящ тидил -ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(21) 4666536/13 (22) 23.03,89 (46) 15.06.91, Бюл (71) Научно-иссле омедицинской тех (72) К,А.Шестако ская и В.И,Кулико (53) 576.8.097 (088 (56) Лукьянов А,Н валентное связыв ковой глобулой мицелл. - Биоор т. 14, М 5, с.670 -(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИП КОНЪЮГИРОВАННЫХ С БАКТЕ НЫМИ АНТИГЕНАМИ(57) Изобретение относится к биотехнологии, касается способов получения липосом, коньюгированных с бактериальными анти- генами, и может быть использовано в иммунологии и медицине для разработки вакцинных и липосомальных диагностических препаратов. Целью изобретения является упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счет увеличеИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и медицине для повышения иммуногенности бактериальных антигенов, создания вакцинных препаратов с использованием липосом в качестве носителя антигенов, а также для разработки липосомальных диагностических препарания эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов. Бактериальные антигены модифицируют фосфатидил(йй - оксисукцинимидилсукцинил)этаноламином одновременно с включением их в липосомы и с процессом формирования липосом из фосфолипидов, Для этого в водном растворе бактериальных антигенов диспергируют смесь, состоящую из фосфолипидов и модификатора, взятых вмолярном соотношении 4-9;1 при массовом соотношении смеси и антигена 10-18;1, полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре и перемешивании, а продукт отделяют центрифугированием, Диспергирование осуществляют либо путем инжекции раствора липидов в органическом растворителе, либо путем ультразвуковой обработки смеси, либо солюбилизацией липидов в растворе дезоксихолата натрия с последующим удалением детергента диализом. Способ обеспечивает практически полное (75 - 100%) сохранение антигенных свойств белковых антигенов. 3 з.п. ф - лы, 3 табл. м е р 1. Смесь липидов(40 мг), ю из фосфатидилхолина и фосфай - (й - оксисукцинимидилсукци 1 б 55503нил)этаноламина в молярном соотношении9;1, растворенную в 30 мкл этанола, впрыскивают в раствор, содержащий 4 мг бруцеллезного протективного антигена(соотношение липид:белок 10:1) в 0,4 мл 50,9-ного раствора йаС, Полученную липидную дисперсию доводят до 0,5 мл путемдобавления 0,9-ного раствора йаО и инкубируют при 37 С при перемешивании втечение 15 ч. Полученный препарат липосом, содержащий бруцеллезный протективный антиген, центрифугируют при 400009 втечение 2,5 ч, и в качестве липосом используют полученный после центрифугированияпреципитат. 15П р и м е р 2. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, номолярное соотношение яичный фосфатидилхолин:фосфатидил - й - (й -оксисукцинимидилсукцинилэтаноламин составляет 204:1.П р и м е р 3. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, нов качестве антигена используют чумной капсульный антиген Ф - 1. 25П р и м е р 4. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 2, нов качестве антигена используют чумной капсульный антиген Ф - 1,П р и м е р 5. К смеси липидов(77 мг), 30состоящей из яичного фосфатидилхолина ифосфатидил - (й - (й -оксисукцинимидилсукцинил)этаноламина в малярном соотношении 9;1, добавляют 2 мл 0,9-ного раствораМаС, содержащего 7,7 мг бруцеллеэного 35, протектинового антигена (соотношение липид:белок 10:1), полученную суспензиювстряхивают и обрабатывают ультразвукомпри частоте 22 кГц и мощности 100-150 Втв течение 5 мин, полученную липосомную 40суспензию инкубируют при 37 Спри перемешивании в течение 5 ч, затемсуспензию липосом центрифугируют(400009; 2,5 ч), и в качестве препарата липосом используют полученный после центрифугирования супернатант.П р и м е р 6, Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 5, номолярное соотношение яичный фосфатидилхолин:фосфатидил-(й-)М -оксисукцинимидилсукцинил)1 этаноламинсоставляет 4;1,П р и м е р 7, Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 5, нов качестве антигена используется чумной 55капсульный антиген Ф.П р и м е р 8. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 6, нов качестве антигена используется чумнойкапсульный антиген Ф,П р и м е р 9, К смеси липидов (54 мг), состоящей иэ яичного фосфатидилхолина и фосфатидил-(М-(И -оксисукцинимидилсукцинилЯэтаноламина в малярном соотношении 9:1, добавляют 0,3 мл 20-ного раствора дезоксихолата натрия, полученную смесь инкубируют 30 мин при перемешивании. К полученной дисперсии прибавляют 1,0 мл раствора, содержащего 3,0 мг чумного капсульного антигена Ф(соотношение липид:белок 18:1), полученную смесь инкубируют при 37 С и перемешивании в течение 3 ч, затем суспенэию подвергают диализу против дистиллированной воды (Зх 2 л) в течение 22 ч, затем суспензию липосом центрифугируют (40000 9;2,5 ч), и в качестве препарата липосом используют полученный после центрифугирования преципитат.П р и м е р 10, Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 9, но молярное соотношение яичный фосфатидилхолин:фосфатидил - (Гч - (й -оксисукцинимидилсукцинил)зтаноламин составляет 4:1,П р и м е р 11. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но в качестве липидов используют суммарные фосфолипиды яичного желтка.П р и м е р 12. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но в качестве липидов используют дипальмитоилфосфатидилхолин.В табл, 1 приведены сравнительные данные предлагаемого и известного способов получения липосом, содержащих бактериальные антигены.Из табл. 1 видно, что по числу стадий и времени, необходимого для осуществления процесса, предлагаемый способ значительно превосходит известный. Предлагаемый способ имеет промышленную применимость, так как все 4 стадии, его составляющие, технологичны и могут быть достаточно просто оформлены в аппаратурном отношении,Предлагаемый способ обеспечивает также высокое качество препарата липосом,Сравнительная характеристика липосом,конъюгированных белками, полученных по предлагаемому и известному способам, приведена в табл. 2. Из данных табл. 2 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение липосом, содержащих белки, характеризующихся высоким молярным соотношением белок;липид, Высокое молярное соотношение белок:липид обеспечивает оптимальную эпитопную плотность белкового антигена на наружнойповерхности липосом и вследствие этого повышает его иммуногенность, тогда как дальнейшее увеличение эпитонной плотности не приводит к существенным изменениям иммуногенных свойств липосом.Предлагаемый способ обеспечивает практически полное (75-100) сохранение антигенных свойств белковых антигенов, тогда как известный способ приводит к снижению функциональной активности белка или к изменению его физико-химических свойств.Предлагаемый способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами обеспечивает максимально возможную сохранность антигенных свойств белка, экспонированного на наружной поверхности липосом, Наличие специфичного антигена на наружной поверхности липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, подтверждено титроеанием БПА-содержащих липосом в реакции кольпреципитации с бруцеллезной поливалентной кроличьей сывороткой, При этом титр исходного бруцеллезного протективного антигена составляет 1:64000.В табл. 3 приведены данные об антигенных свойствах бруцеллезного протективного антигена, конъюгированного с липосомами разными методами.Как видно из табл. 3, предлагаемый способ обеспечивает относительную антигенную активность, сравнимую с антигенной активностью свободного бруцеллезного протективного антигена, тогда как другие способы в этом отношении малоэффективны.Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно упростить процесс получения липосом, конъюгироввииых с бактериальными антигенами, и повысить их качество за счет повышенной эпитопной.плотности белка на поверхности липосом и сохранения при этом его антигенной активности,5формула изобретения 1. Способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, предусматривающий модификацию .белко ваго антигена фосфатидил-й-(й-оксисукцинимидилсукцинилЦэтзноламином, формирование липосом иэ фосфолипидов, включение антигена в липосомы с последующим инкубированием и выделением целе вого продукта центрифугированием, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества целевого продукта за счет увеличения эпитопной плотности белка на поверхности липосом 20 при сохранении антигенных свойств белковых антигенов, модификацию и включение антигенов осуществляют одновременно с формированием липосом путем диспергированиясмеси фосфатидил-(й в (й -оксисук цинимидилсукцинилЦэтаноламина сфосфолипидами в молярном соотношении 4-9;1 в водной - солевом растворе белкового антигена при массовом соотношении антиген:смесь 1:10-18.30 2, Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что диспергирование осуществляют путем ультразвуковой обработки при 22 кГц и мощности 100-150 Вт.3. Способпо и. 1, отл ич а ю щи йс я 35 тем, что перед диспергированием к смесидобавляют дезоксихолат натрия с последующим удалением детергента диализом.4. Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что смесь растворяют в этаноле и дис пергирование осуществляют путем инжек- ции1655503 Таблица 1 Предлагаемый способ иве естный способ Стадии процесса Стадии процесса Приготовление смеси липидон 0,25 Получение липосомметодом ипжекции 0,1 3,0 Проведение реакцииконъвгирования белка с липосомами 2,5 Ковалентное связывание белка сфосфатидилМ 1,5 3-кратяап промыв" ка белка ацетоном Удаление остаткаацетона при пониженном давлении Прнготогзенне липидной смеси 24,0 0,514,0 Встраивание модифицированного бел"ка в липосомы Для иммуноглобулина С,адлЯ о 1 -химотРипсина.еа"Для чумного капсулъного антнгена ф"1. Получение .системыобращенных мицеллдиизооктилсульфосукцината в гексане Солюбчлизациябелка в системеобращенных мнцепл и инкубация мицеллярногораствора, содержащего белок-(Б -оксисукцнннмиднлсукцинилВэтанолвмином всчстеме обращенных мицелл Осаждение белка ацетоном и фентрифугиронаниеосадка белка Получение чнпосом методом обращения фаэ и включение в липосомы флусрвсцентного маркера Отделение несвязанного с липосомами белка центрифугированием вступенчатом градиенте фиколлаВремя, необходимое для выполнения . стадий, ч Отделение несвязанного балка отлипосом центрифугированием Время, необходимое длявыполнениястадий, ч10 1655503 Таблица 2 Показатели Значение показателей при использовании типа. белков нли белковык внтигенов 4 "хнмо Иммуио; Лизоцим Чумной аллее трипсин бу- капсуль прете,8 3,9500 18-1,2 ."140-300 мол Сохранениена 80 Х антнгенныссвойств УмейьаеннеФункцнональраствори . ная актив мости, бел- ность не ка и 00 раз изучалась и бовин взависимостиот сгеиеинего модифи- .кации охранятся 60 Х Сохраиенифункционалной активности белк каталитичесхойактивности Ь-(к -оксичто соотвезиведено в мгу Хар осом приведены для нил) этанапам 1 на (1 в формуле изобрете протектнвкого анти -эа гетерогениости раэнык количеств фосфатнднп- С 20 молЛ в составе липосо 94 ня соотноиенюз компонентов сна отпевание белок/липид антигена по белковому сос сукцнствуДля тав Т лица Спосо ния препарата липос Относительная антнгенная ак тнвиость Свободный бруцеллезный антигенПА пассивно сорбированиый на пай поверхности фосфатидилновых (ФХ) липосом, полученметодом ннлекцни руин нный в ФХ-линос методом инкекцн БПА вклюнолученн+ БПА, модифицированный пальмнтнновой кислотой и включенный вФХ-липосоны, полученные методомннкекции-оксиламин,БПА, козалентно связанный сФХ липосомами содеркалюф/1 О мол.Х фосфатиднллл-(Я -оксисукцннимнднпсукцинилЦэтаноламифна (предлагаеьый способ)+ оставитель О. Комароваехред М.Моргентал Корректор В. Гирняк дактор н Тираж 477 Подписноевенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР е 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 каз 2010 ВНИИПИ Гос изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1011 -ктернстики ли нимидилсукци ет указанному бруцеллезног а/мг лнпидаПА, ковелентно сулной поверхностодерквщих фосфатид укциннмидилсукцн олученных методом сокр анели витигенны свойств бе .ковых антн- генов