Способ получения растений-регенерантов эспарцета

ляная кислота (ИМ 1 1,5- 2 мг/л и культивируют в стандартных условиях. Полученные каллусы для размножения помещают на 20-24 дня (2 пассаж) на5 питательную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу, индолилмасляной кислоты О, 20-0,25 мг/л, бензиламинопурина 0,05-0,10 мг/л (6 БАП), пептон-гидролизата 200- 250 мг/л, зеатин-рибозида 0,55 0,65 мг/л и оставляют в тех же условиях. Затем для получения эмбриогенных структур каллусы переносят на 10- 12 дней (3 пассаж) на жидкУю среду Мурасиге-Скуга с половинным содержанием солей и витаминами по прописи с добавлением тех же компонентов в тех же концентрациях и культивируют при 16-часовом фотопериоде и стандартных температурных условиях и медленном качании, затем (4 пассаж) переносят на твердую среду на 20-24 дня, этого же состава, исключая пептонгидролиэат, с добавлением 0,30-0,35 мг 25 б Д-диметилаллиламинопурина (бД-ц) и культивируют при тех же условиях до .появления регенерантов, которые за тем пересаживают с добавлением индо лилуксусной (ИУК)кислоты 0,50 - 0,55 мг/лП р и м е р, Проводят стерилизацию исходного эксхлантата, высадкуего, размножение полученного инициального каллуса, пересадку его дляобразования. эмбриогенных структур,регенерацию из них растений, исполь-,зуя модификации питательной средыМурасиге-Скуга, и заключительнуюпересадку растений для образованиякорней на модифицированную средуШенка-Хильдебрандта, и дальнейшеевыращивание растений при 16-часовомфотопериоде. При этом в первичную.45инициальную среду с солевой основойи витаминами по Мурасиге-Скугу вносят:лилмасляной кислоты и культивируютв темноте. Для размножения каллусноймассы в среду с солевой основой ивиТаминами по Мурасиге-Скугу добавляют 0,2 мг/л индолилмасляной кислоты0,05 мг/л, б-бензиламинопурина,200 мгл/л пептон-гидролизата,0,55 мг/л зеатнн-рибозида .и культивируют в темноте. Получение эмбриогенных структур и регенерацию осуществляют на среде Мурасиге-Скуга с половинным содержани "м солей и витаминами (полностью по прописи) с компонентами предыдущего этапа, исключив пептон-гидролизат и добавив0,3 мг/л бо-диметилаллиламинопурина.Заключительную пересадку для ускоренного образования корней и растений осуществляют на среду Шенка-Хильдебрандта с добавкой 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты и выращивают при1 Ь-часовом фотопериоде,Аналогично примеру 1 осуществляютдругие примеры, при этом проанализирована возможность использования различных эксплантатов и различныхконцентраций добавок к среде,Результаты исследований представлены в табл. 1-6.Использование изобретения позволяет за 10-12 недель за счет оптимизации образования эмбриогенного каллуса и его быстрой и массовой регенерации увеличить выход растений эспарцета из культуры тканей, облегчитьпроцесс размножения и укоренения, атакже расширить объем работ по клеточной селекции для получения исходного материала с ценными хозяйственными признаками для ускоренного создания новых сортов эспарцета.Ф о р м у л а и з о.б р е т е н и я,.1, Способ получения растений-регенерантов эспарцета, включающий стерилизацию исходного эксплантата, посадку его на питательную среду, получение и размножение инициального каллуса, пересадку его на среду для образования эмбриогенных структур, регенерацию из них растений, пересадкуих на среду для корнеобразования идальнейшее выращивание при 16-часовом фотопериоде, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения количества получаемых растений за счетмассовой регенерации, независимо отособенностей генотипа, получениеинициального каллуса осуществляют напитательной среде Мурасиге-Скуга, вкоторую дополнительно вносят тригонеллин и индолилмасляную кислоту,размножение каллуса проводят на питательной среде Мурасиге-Скуга, до"полнительно содержащей индолилмасляную кислоту, б-бензиламинопурин, пептон-гидролизат, зеапин-рибозид, образование эмбриогенных структур ирегенерацию из них растений осущестТаблица 1Частота индукции каллуса в зависимости от эксплантатаи инициальной среды (Е от эксплантата). Сорт Закавказский Вариант среды по способу Эксплантат предлагаемому известному Мурасиге- Скуга МурасигеСкуга Линсмайер ЛинсмайерСкуга Скуга 2,4 Д к-та 1 КК + три,4 Д к-та 6-БАПгонеллин 6-БАП 50,8+2,7 66, 1+3, 1 70, 1+1,8 СемядолиЛистьяСтебли 95,1+2,3 60,9+2,3 93,7+2,8 88,7+1,9 96,8+3,1 86,2+3,3 37,9+3,4 47,0+3,1 80,8+2,8 Таблица 2 Влияние различных концентраций ИМК на индукцию каллусаВариант среды Эксплантат МурасигеСкуга МурасигеСкуга Мур асиг еСкуга ИМК1,5 мг/л ИМК + ИМК + + 9-10 мг/л + 11-12 мг/и тригонеллин тригонеллин 66,8+3,4 80,1+3,7 73,7+2,9 88,9+1,9 91,7+3,7 95,8+2,4 75,7+2,7 87,0+4,088,7+2,5 Семядоли .ЛистьяСтебли 5 16 вляют на питательной среде Г 1 урасиге Скуга, содержащей микро- и макросоли в количестве, равном половинному, указайного в прописи, в которую дополнительно вносят индолилмасляную кислоту, 6-бензиламинопурин, зеатинрибозид и 6-диметиламинопурин, и дальнейшее ускоренное образование корней проводят на среде Шенка-Хильдебрандта, в которую добавляют индолилуксусную кислоту.2. Способ по п1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в среду для получения инициального каллуса триго- неллин вносят в количестве 9-10 мг/л, индолилмасляную кислОту - в количестве 1,5-2 мг/л.3. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в среду для раз 307076множения каллуса вносят индолилмасляную кислоту в количестве 0,20 -0,25 мг/л, 6-бензиламинопурин - вколичестве 0,05-0,10 мг/л, пептон"гидролнзат - в количестве 200-250 мг/л,зеатин-рибозид - в количестве 0,55 -0,65 мг/л,4. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в среду для образования эмбриогенных структур вносят компоненты по п.З, а пептон-гидролиэат заменяют на 6-диметиламинопурин, который вносят в количествеО,ЗС,35 мг/л. 5. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в среду для корнеобразования вносят индолилуксусную 20 кислоту в количестве 0,50-0,55 мг/л.11630707 Таблица 3Влияние компонентов среды на интенсивность накоплениякаллуса (прирост в Е к исходной величине). Сорт Закавказский1 ф Среда Мурасиге-Скуга Показатели ИМКБАПЗеатинрибоэид 249-300 250-340 140-178 170-200 160-198 150-208 180-238200-220190-248 За 2 пассажаМинимум-максимумВ трех независимых опытах 207-219 169-211 298-370 Таблица 4 Среда Мурасиге-Скуга 1/2 солей Показатели 6-БАПИМКЗеатинрибозид б-БАПИМКб-Д6-БАПИМКЗеатинрибозид ИМКЗеатинрибозид 360-600 150-168 178"200 195 59 117 54 П р и м е ч а н и е. 1все четыре компонента (по предлагаемому способу); 2:3:4 - с отсутствием одного из компонентовсоответственно.Таблица 5Влияние питательной среды наобразование корней у растений-реге.нерантов эспарцета в трех независимых опытах,:Х, Добавлена ИУК 0,500,55 мг/л во все среды,Вариант. среды ШенкаХильдебрандта Гамбор БМурасиге- Скуга Закавказский3,1 27,1 2,1 15,1 57, 47,2 Образованиеэмбриодов10 1630707Продолжение табл.5Влияние питательной среды на образование корней у растений-регенерантов эспарцета в трех не,зависимых опытах, Х. Добавлена ИУК 0,50 - 0,55 мг/л во все среды Вариант среды Гамбор БМурасиге- Скуга ШенкаХильдебрандта 0Сорт Песчаный5,88,10Сорт Мустанг11,214,37,2 33,1 18,3 12,1 7,4 63,1 59,8 40,3 39,2 24,7 171 80,1 49,3 76,1 Таблица 6Инициация каллусных культур из эксплантатов сорта Закавказский в зависимости от условий культивирования черездней от момента посадки,й Среда Мурасиге-Скугас добавлением ИМК итригонеллина (по предлагаемому способу) Эксплантат В темноте (по предлагаемомуспособу) При освещении (поизвестному способу) ЛистьяСемядолиСтебли 70-73 58-61 83-86 51-57 38-38 70-75 Составитель В,ДемкинРедактор С.Лисина Техред ,М,Моргентал Корректор Н.РенскаяЗаказ 505 Тираж 348 ,ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при. ГКНТ СССР113035 Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 г1 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101