Способ определения сократимости кардиомиоцита

сооз советсних социАлистичесни СПУБЛИН 9) (И))4 С 01 Б 3 4 ный комитет ссср тЕНий и отнрцт госуддрственПО ДЕЛАМ ИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРС о(71) Институт проблем механики АН СССР(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии для диагностики состояния миокарда на клеточном уровне сердечно-сосудистых заболеваний и в фармакологии для определения механизмов действия лекарственных веществ. Цель изобретения - повывение точности способа путем определения оцен ки сократимости кардиомиоцита за счет измерения параметров сокращения при физиологически нормальных условиях, Для его ферментативного выделения, прикладывания стимула и визу" альной оценки сокращения после выделения кардиомиоцкта к одному его концу прикрепляют закреппенный в держателе рычаг, к другому концу - стержень с осесимметричным телом на конце, заводят последнее в цилиндрический канал, а нагрузку на кардномиоцитзадают путем создания потока жидкости в канале, кроме того, прикрепление к кардномиоцнту рычага и стержня производят путем подведения к кардиомиоциту жестко закрепленного вмикроманипуляторе рычага с развоенным концом и капелькой биологического клея внутри раздвоения с установкой просвета раздвоения над однимконцом кардиомиоцита н последующимопусканием рычага и подведения через 3-5 мин ккардиомиоциту стержняс заполненным клеем раздвоением наодном конце с осесимметричным теломна другом и с боковым отводом, закрепленным с возможностью освобождения в зажиме другого манипулятора,с установкой просвета раздвоениянад другим торцом кардиомиоцита, споследующим опусканием стержня иего освобождением через 3-5 мин,Кроме того, рычаг и стержень изготовлены скручиванием нз тонкой проволоки. 1 нлИзобретение относится к медицине,а именно к способам диагностики оостояния миокарда на клеточном уровне, и может быть использовано в кардиологии для диагностики сердечнососудистых заболеваний, в физиологиидля исследования механизмов регуляции сократимости миокарда и в фармакологии для определения механизмов 10действия биологически активных веГществ.Цель изобретения - повышение точ,ности способа за счет воэможностиисследования в физиологических условиях.Способ определения сократимостикардиомиоцита осуществляют следующимобразом,Каплю суспензии ферментативно вы" 20деленных кардиомиоцитов помещают впрозрачную перфузионную камеру 1(фиг. 1), размещенную на предметномстолике микроскопа. Выбирают неповрежденный кардиомиоцит, подводят к 25одному его торцу закрепленный в микроманипуляторе 2 стержень 3 с раздвоением на конце и с капелькой биологического клея в просвете раздвоения, Раздвоение устанавливают над 30торцом кардиомиоцита 4 и опускаютстержень 3 с помощью микроманипулятора 2 так, чтобы клей в просвете раздвоения стержня 3 охватил торец кардиомиоцита 4. Через 3-5 мин, необходимых для надежной полимеризацииклея, к другому торцу кардиомиоцитаподводят второй стержень 5 с раздвоением на конце и с капелькой биологического клея в просвете раздвоения. Стержни 3 и 5 могут быть изготовлены путем скручивания из тонкой проволоки диаметром не более1 О мкм. На конце стержня 5 имеетсяшарик 6, который проще всего изготовить путем нанесения на конец стержня капельки клея, Диаметр шарика 6составляет 5-10 диаметров стержня5, а длина стержня 5 -"10-15 диаметров шарика 6, Стержень 5 .зажат вмикрозажиме 7, закрепленном во втором микроманипуляторе 8. Раздвоениеустанавливают над вторым торцом кардиомиоцита 4 и опускают стержень 5с помощью,микроманинулятора 8 так,чтобы клей охватил торец кардиомиоцита 4, Через 5 мин после полимеризации клея освобождают микроэажим 7и с помощью микроманипулятора 2 перемещают кардиомиоцит 4 со стержнями 3 и 5 влево таким образом, чтобы шарик б зашел в цилиндрический канал 9. Диаметр цилиндрического канала 9 составляет 1,1-1,5 диаметра шарика 6. Затем по цилиндрическому ка.налу создают поток жидкости, обеспечивая усилие на кардиомиоцит. Чрезмерное растяжение кардиомиоцита предотвращается упором бокового отвода стержня 5 в стенку цилиндрического канала 9. Затем через платиновые электроды 10 и 11 производят электростимуляцию кардиомиоцита 4 импульсами длительностью 10-15 мс напряжением 30-50 В и частотой 0,1-0,6 Гц, Процесс сокращения кардиомиоцита 4 регистрируют на кинопленку путем съемки через микроскоп.П р и м е р 1. Определение скоростной компоненты сократимости кардиомиоцита крысы.Брали крысу линии Вистар весом 280 г , производили ее декапитацию, вскрывали грудную клетку и отсекали сердце на уровне дуги аорты и предсердий. Получение кардиомиоцитов производили по стандартной методике Айзенберга. Проводили ретроградную перфузию изолированного сердца по методике Лангендорфа под давлением 80 мм рт.ст, бескальциевым раствором Тироде в течение 15 мин, подключив сердце к специальной перфузионной системе. В течение 15 мин пер+ фузировали сердце при том же давлении стандартным раствором Тироде с добавлением 0,17. коллагеназы. Сердце отсоединяли от перфузионной систеид, рассекали на куски размером 2-4 мм, которые помещали в камеру с мешалкой и с нормальным раствором Жроде плюс 0,1 Е коллагеназы на 15 мин, затем сливали раствор с поврежденными при рассечении сердца кардиомиоцитами и наливали свежий. Через 30 мин полученный раствор сливали и центрифугировали при 10 я в течение 10 мин. Раствор сливали, а в пробирку с кардиомиоцитами наливали нормальный раствор Тираде без коллагеназы.Капшо суспензии кардиомиоцитов помещали в специальную прозрачную перфузйонную камеру, размещенную на предметном столике микроскопа фирмы "Карл Цейсц. Выбирали неповрежденный кардиомиоцит кардиомиоцит считался10 15 20 неповрежденным, если отсутствовали его спонтанные сокращения и нарушения формы) длиной 75 мкм и шириной 18 мкм, Подводили к торцу кардиомиоцита жестко закрепленный в микро- манипуляторе рычаг с раздвоенным концом, изготовленный скручиванием из медной проволоки диаметром 10 мкм с капелькой биологического цианакрилатного сосудистого клея внутри раздвоения. Раздвоение устанавливали над торцом кардиомиоцита и опускали рычаг с помощью микроманипулятора так, чтобы клей охватывал кардиомиоцит, Через 5 мин клей полимеризовался, после чего к другому торцу кардиомиоцита подводили стержень с раздвоением на конце, в котором помещали капельку биологического клея Стержень изготавливали из медной про-. волоки диаметром 10 мкм путем скручивания таким образом, чтобы образовать боковой отвод на расстоянии 200 мкм от разветвления длиной 100 мкм. За отводом стержень имел длину 1200 мкм. На конце стержня имелся шарик диаметром 75 мкм, полученный путем нанесения капельки эпоксидного клея. Боковой отвод размещали в зажиме, установленном на микроманипуляторе. Раздвоение устанавливали над свободным концом кардиомиоцита и опускали стержень так, что клей охватывал торец кардиомиоцита. Через 5 мин после затвердевания клея подводили сбоку цилиндрический канал внутренним днаметром 100 мкм так, чтобы от торца канала до бокового отвода было расстояние 200 мкм. Затем разжимали зажим, освобождая боковой отвод, и удаляли зажим из поля зрения микроскопа с помощью микроманипулятора. К цилиндрическому каналу подавали разрежение нужной величины. Шарик стержня предварительно был откалиброван таким образом, что было известно, какое . усилие на кардиомиоцит создается при создании заданного разрежения. Калибровка шарика проводилась с помощью торсионных весов.Устанавливали разрежение, достаточное для того, чтобы боковой отвод прикоснулся к торцу цилиндрического канала, Оно равнялось 4,2 мм рт.ст.Затем подавали через платиновые электроды, расположенные на расстоянии 50 мкм от кардиомиоцита, электрические импульсы длительностью 15 нс 25 30 35 40 45 50 55 напряжением 36 В и частотой 0,5 Гц, Одновременно цилиндрический канал перекрывали ниже шарика по потоку так, что усилие, приложенное к кардиомиоциту, становилось равным нулю, Происходило сокращение кардиомиоцита, которое регистрировалось на киноплен-ку камерой "Красногорск". Максимальная скорость сокращения кардиомиоцита равнялась 2,1 1/с (180 мкм/с), что свидетельствует о хорошей ско- ростной компоненте сократимости миокарда (максимальная скорость сокращения папиьчярной мышцы крысы в нороме при 22 С равняется 1,7 + 0,2 1/с).П р и м е р 2. Определение силовой компоненты сократимости кардиомиоцита крысы.Брали крысу линии Вистар весом 260 г. Ферментативное выделение кар диомиацита производили аналогично йримеру 1. Был выбран кардиомиоцитдлиной 67 мкм и шириной .16 мкм. Прикрепление кардиомиоцита производилианалогично примеру 1.Устанавливали разрежение3,4 мм рт.ст. до касания боковымотводом торца цилиндрического канала, прикладывали электрические импульсы длительностью 10 мс, напряжением 42 В и частотой 0,5 Гц.и наблюдали сокращения,Затем устанавливали заведомобольшое разрежение 120 мм рт.ст,так, что клетка не могла сократиться, После этого постепенно уменьшали разрежение до появлении первыхпризнаков перемещения мышцы, которое наблюдалось при разрежении56 мм рт.ст, Это соответствовалоусилию 0,047 мг и напряжению0,23 г/мм, что соответствует о хорошей силовойкомпоненте сократимости миокарда. (Напряжение, развиваемое папиллярной мышцей крысы в норме, составляет 0,1-0,15 г/мм ).i р и м е р 3. Определение силовой компоненты сократимости кардиомиоцита крысы после ишемическогоповреждения.Брали крысу весом 250 г.ферментативное выделение и прикрепление кардиомиоцита производили аналогичнопримеру 1, однако после перфузиибескадьциевым раствором производилиостановку перфузии на 10 мин для созсоэдания ишемии. Был выбран кардио-.миоцит размером 72 х 18 мкм.Измерялимаксимальное изометрическое .напряжениеаналогично примеру 2, которое оказалось равным 0,019 мг, что соответствовало напряжению 0,08 г/мм Это свидетельствует о том, что ишемическое повреждение существенно .снизило сократительную способность кардиомиоцита.П р и м е р 4. Определение дис персии сократительных свойств кардиомиоцитов крысы.- К крысы линии Вистар весом 270 г в соответствии с примером 1 получали кардиомиоциты. Измерения максимального изометрического усилия кардиомиоцитов проводили в соответствии с примером 2, Было определено, что напряжение, развиваемое кардиомиоцитами крысы, равно 0,18 + 0,01 г/мм 20 Это говорит о малом разбросе сократительных свойств кардиомиоцитов крысы в норме.П р и м е р 5. Определение влияния биологически активных веществ 25 на сократимость сердечной мышцы крысы.У крысы весом 2 бО г был получен . кардиомиоцит длиной 76 мкм и шириной 20 мкм в соответствии с примером 1, 30 Прикрепление кардиомиоцита и измерение максимального изометрического усилия производили аналогично примеру 2, Измеренное усилие равнялось 0,038 мг, Затем.в раствор добавляли раствор дигоксина иэ расчета 5 х х 1 О" г/л, после чего вновь измеряли максимальное изометрическое уси. лие, которое оказалось равным 0,051 мг, т.е. на 37 больше. Это 40 говорит о существенном положительном изотропном влиянии дигоксина на сократительную активность кардиомиоцита крысы.Дисперсии измеряемых характеристик 45 уменьшаются по сравнению с прототипом. Если при работе по известному способу среднеквадратичный разброс максимальной скорости сокращения больше 20 , то при использовании предлагаемого способа этот разброс не превышает 5%. Повышение точности достигается также за счет того, что в предлагаемом способе кардиомиоцит сокращается в физиологических условиях, под нагрузкой, составляющей 25-30 . от максимального изометрического усилия, в то время как нагрузка на кардиомиоцит в известном способе равна нулю.Формула иэ обретенияСпособ определения сократимости кардиомиоцита путем его ферментативного выделения, закрепления в камере, заполненной буферным раствором, электрической стимуляции с последующей регистрацией сокращения, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет воэможности исследования в физиологических условиях, при закреп ленни кардиомиоцита к одному его торцу подводят стержень с раздвоением на конце и каплей биологического клея в просвете раздвоения, выдерживают в течение 3-5 мин, к другому торцу кардиомиоцита подводят фиксированный в зажиме стержень с раздвоением на одном конце и каплей биологического клея в просвете раздвоения и шариком на другом конце, вновь вы- держивают в течение 3-5 мин, освобождают второй стержень, перемещая первый стержень, вводят шарик в ци" линдрический канал, затем дополнительно создают нагрузку на кардиомиоцит потоком раствора, пропускаемого в камере через цилиндрический канал, при этом диаметр шарика составляет 5-10 диаметров второго стержня; диаметр цилиндрического канала - 1,1- 1,5 диаметра шарика, а длина второго стержня - 10-15 диаметров шарика./5 Проектная Производственн графическое предприятие, г. Узтор ВНИИПИпо113035,аж 847 ПодписноеГосударственногокомитетаСССелаи изобретений и открытийосква, Ж 35, Раушская наб д.