Способ определения концентрации иммунного комплекса и устройство для его осуществления

.3431255,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Всесоюзный научно-исследовательский и конструкторский институт медицинской лабораторной техники и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почет. акад.Н.Ф.Гамалеи (72) Б.А.Ворогушин Г;А.Вильнер, . И.А.Кружалова, А.А.Опалев, И.СРозен И.Г.Баландин, И.П.Павлова и К.Л.Шаханина(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИИММУННОГО КОМПЛЕКСА И УСТРОЙСТВО ДЛЯЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ(57) Изобретение относится к иммунохимии, в частности к колориметрическим способам и фотоэлектрическим устройствам, для оценки ферментативнойактивности. Целью изобретения является повышение чувствительности иммуноферментного анализа, а также повышение чувствительности первичногопреобразователя, упрощение конструкции устройства и уменьшение объемаисследуемой пробы. Для этого фотомет 801368728 А 1 рирование проводят при длине волны550-570 нм, при этом в качестве источника излучения используется светодиод, и в устройство введенылогариф-.мирующий аналого-цифровой преобразователь отношения двух сигналов истабилизированный генератор прямоугольных импульсов, выход которогосоединен со светодиодом и запускающим входом аналого-цифрового преобразователя, причем первый вход преобразователя соединен с источником опорного напряжения, соответствующегонулевой концентрации, второй вход -с выходом усилителя. В основе способа лежит применение метода иммуноферментного анализа, при котором специфические антитела и антигены соединены с поверхностью твердой фазыпутем адсорбции. Соединение ферментконьюгированных антител и антигейапроводится прямым или непрямо вариантом. О количестве определенноговещества судят по количеству связанной метки (фермента), измеряя интенсивность окрашивания субстрат - индикаторного раствора. При использовании коньюгатов иммуноглобулинов спероксидазой наиболее доступными ичувствительными субстратами являются5-аминосалициловая кислота и ортофенилендиамин. 2 с.п. ф-лы, 2 ил.13687Изобретение относится к областииммунохжии, в частности к областикалориметрических способов и фотоэлектрических устройств для оценки Ферментативной активности, предназначено для количественной оценки результатов различных вариантов иммуноферментного анализа (ИФА) при определении антигенов и антител к ним и может быть использовано в лабораторияхнаучно-исследовательских и лечебнопрофилактических учреждений различного профиля.Целью изобретения является павы гшение чувствительности определения,и упрощение конструкции устройства,На Фиг.1 представлень 1 спектральные характеристики субстрат-индикаторного раствора 5-аминосалициловой 20кислоты," на фиг.2 - устройство дляреализации способа.Устройство включает в себя стабилизированный генератор 1 прямоугольных импульсов, источник излучения - 25светодиод 2 зеленого свечения, излучающий в области спектра 550-570 нм,кювету 3 с исследуемой пробой, приемник излучения - Фотадиод 4, усилитель 5, лсгарифмирующий аналога-цифравой преобразователь 6 и блок 7цифровой инцикации.Способ асущеетвляется следующимааразам,Твердофазный носитель (шарис изполимера) вносят в 200 мкл раствораспецифических антител (антигена) иинкубируют 2 ч прн 37 С или 16 ч при4-.6 С, От избытка несвязаьшихся антител (антигена) носитель отмывают ФосФатна-салевым буферным раствором(ФСБР)с добавлением 0,05% твина.Носитель ". лмабилизованными антителами (антигеном) вносят в исследуемую пробу, содержащую искомыйантиген (антитело). После инкубациив течение 30 мин при 37 С твердофазный носитель отмывают от несвязавшихся реагентов ФСБР 0,05 таин.Носитель, на поверхности которогонаходится комплекс антитейо - антиген, вносят в 200 мкл раствора конъюгата (специфические иммуноглобулины,меченые Ферментом - перексидазой).После 30 мин контакта йри 370 С"носитель промывают ФСБР + твинот несвязавшегося конъюгата.Носитель, содержащий иа поверхности комплекс антитело - антигенмеченое 28 2антитело, вносят в 500 мкл субстрат- индикаторного раствора (Орта-феню идиамин, 5-аминосалициловая кислота)., Через 30 мин реакцию останавливают добавлением в пробу равногс Объема 1 н,раствора серной кислоты или ЫаОН и субстрат индикаторный раствор Фотометрируют при длине волны 550-570 ам, 0 количественном содержании искомого антигена - антитела судят па ферментативной активности связавшегося Фермента (разрушение Ферментнага субстрата, дающее окрашенный продукт) по величине оптической платности,Устройство, реализующее способ,работает следующим образом.Сигналы с выхода генератора 1поступают на светодиод, который излу"чает последовательность световых прямоугольных импульсов, проходящих через кювету с .субстрат-индикаторнымраствором и падающих на поверхностьФатодиода, Амплитуду тока питания вимпульсе можно увеличить в 5-8 разпо сравнению с допустимой величинойпостоянного тока питания светодиода.При,цастаточно большой скважности(50-100) средняя мощность, потребляемая светодиодом, ,в 6-20 раз меньше,чем при постоянном токе питания. 0 дновременно удается значительно увеличить мошность излучения светодиодаимпульсе, так как она возрастаетпо показательному закону с увеличением тока питания,В качестве Фотоприемника мажетбыть применен любой кремниевый фотодиад с малой площадью Фоточувствительной площадки (2-3 мм), Схемаусилителя является сравнительно прос-" той и не требует компенсации. дрейфа нуля, так как усилитель работает ь импульсном режиме.Сигнал с выхода усклителя па-.тупает на вход логарифмирующ гапалого-цифровога преобразователя стнсшения, на другой вход которога:;сступает сигнал ссатветствуюший значению нулевой канд нтрации. Для запуска г 1 реабраагав теля не требуется специалиной схемы запускающие :мпульсыпоступают с выхода генераторапрямаугальных импульсовС выхода преобразователя на входблока индисации паступа-:т г:о ледователькОсть импульсов чеслО которыхсоответствует значению ОпределяемойЧув осо твительноствыражением Б пред ляет,где Т н створа,светопроп концентра з 1 З1оптической плотности субстрат-индикаторного раствора.В основе способа лежит применениеметода ИФА, при котором специфические антитела или антигены соединеныс поверхностью твердой фазы путем адсорбции, ковалентно или другими методами. Соединение фермент-конъюгированных антител и антигена проводится прямым или непрямым вариантом. 0количестве определяемого вещества судят по количеству связанной метки(фермента), измеряя интенсивность окрашивания субстрат-индикаторногораствора. При использовании конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазойнаиболее доступными, дешевыми и достаточно чувствительными субстратамиявляются 5-аминосалициловая кислотаи орто-фенилендиамин,При большйх разведениях растворас увеличением длины волны имеютсялибо незначительные уменьшения оптических плотностИ (разведение 1;8),либо оптические плотности практически не меняются (разведение 1:16).При этом оптическая плотность исходного субстрат-индикаторного растворарезко уменьшается с увеличением длины волны,С переходом в длинноволновую область спектра при малых концентрациях иммунологически активного вещества оптическая плотность растворапрактически не уменьшается, при этомимеет место сужение динамическогодиапазона измеряемых оптических плотностей. В связи с этим для повышениячувствительности колориметрическогометода при измерении малых концентраций целесообразен переход в длинноволновую область спектра с одновременным увеличением разрешающейспособности первичного преобразователя.При переходе на длинноволновуюобласть спектра ( =550-570 нм) удается упростить устройство, реализующее способ, так как в качестве источника излучения мозно испольэоватьсветодиод.68728 Анализ экспериментально обобщенныхспектральных характеристик субстратиндикаторных растворов показал, чтоих оптическая плотность В может бытьаппроксимирована выражением0=0 Р 4)+гР,.)е 1,е Л,2 Р коэффициентимеют вид201,1 Ър(3)Е =1-Ег 1 1р -0,7.Для раствора 0-фенилендиамина оп 25тическая плотность аппроксимируетсявыражением, аналогичным (2), но сдругими значениями коэффициентов ЕГ 1Светопропускание30-йг-"10-Е во (Е г е где Е- коэффициент экстинции при=450 нм.Зс( 35 Исследование функции показаЗгло, что величина длины волны 1макс фпри которой достигается максимум чув.ствительности, определяется форму лой макс =450+100 Иэ расчетов по формуле45 ет, что при уменьшении конраствора от максимума до зсоответствующего 05 ь Ою 51 м аксуменьшается от 650 до 510 нм; для0,1 ( 0 (0,5 чувствительность Ы неэ0 начительно уменьшается при переходс длины волны 3 = 450 нм на длинуволны М =550 нм. Так, ь =0,92 иЛ до =087 для Р=0,4; или ссф 60 ф ф1 ф 54 при уф Оф 15Для Р,(0,1 чувствительность сне зависит от длины волны в диапаане 450 - 650 нм.При больших концесообразен переход в(6) следуцентрацийначения,нтрациях целедлинно-волновую где Р, - оптическая плотность раст вора на длине волны 3=513687 область спектра, причем оптимальная длина волны. меняется в зависимости от концентрации от 650 до 510 нм.При переходе на эту длину волны550-570 нм для П=2 чувствитель ность увеличивается в 4 раза; для Р , =1 - в 1,5 раза; для П , =05 чувствительность не меняется при переходе в укаэанную область спектра. 10 Таким образом, удается повысить чувствительность первичного преобразователя при малых светопропусканиях, что позволяет повысить отношение сиг Б нал/шум,Формула изобретения Способ определения концентра ции иммунного комплекса антиген - антитело в субстрат-индикаторном растворе 5-аминосалициловой кислоты или орто-фенилендиамина, включающий зондирование раствора и регистрацию интенсивности прошедшего через него из. .лучення, по которому судят о концент 28брации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью повышения чувствительности способа, зондирование проводят на длине волны из диапазона 550 -570 нм.2. Устройство для определения концентрации иммунного комплекса, содержащее светодиод, вход которого соединен с источником питания, и расположенные по ходу излучения кювету для исследования вещества, фотодиод, выход которого соединен через усилитель с аналого-цифровым преобразователем, выход которого соединен с блоком цифровой индикации, и источник опорного напряжения, о т л и ч а ющ е е с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности измерения, упрощения конструкции, источник питания выполнен в виде генератора импульсов, аналого-цифровой преобразователь выполнен логарифмирующим, при этом источник опорного напряжения и генератор импульсов соединены с входами логарифмирующего аналого-цифрового преобразователя.1368728 Составитель С.Голубеведактор Л.Гратилло Техред М,Дидык Коррек Ко 847ственного зобретенийау )КеПроизводственно-полиграФическое предприятие, г,ужгород,ул.Проектная Заказ 282/43 Т ВНЛИПИ Госуд по делам 113035, Моск