Способ диагностики туберкулеза

СОЮЭ СОВЕТСНИХСОЦИДЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК эсю А 61 К 39/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПЮ ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУРч 1 Риц(54)(57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА, включающий приготовлениегистологического препарата, нанесениена него в равных объемах специйической нелюминесцирующей иммунной сыворотки и люминесцирующей сывороткипротив глобулинов того ящвотного,от которого получена нелюминесцирующая сыворотка, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью повьппения точности диагностики, препарат последовательно обрабатывают неразведенным 2-меркаптозтанолом и 0,17-нымраствором пепсина, а нелюминесцирующую и люминесцирующую сыворотки вносят в виде смеси, имеющей концентрацию антител 2:1 соответственно.1 112Изобретение относится к медицине,преимущественно к средствам лабораторной дифференциальной диагностикитуберкулеза.Известен способ диагностики туберкулеза, включающий приготовлениегистологического препарата, нанесение на него в равных объемах специфической нелюминесцирующей иммуннойсыворотки и люминесцирующей сыворотки против глобулинов животного, откоторого получена нелюминесцирующаясывороткаПри наличии искомогоактигена наблюдают специфическое периферическое свечение в люмикесцентком микроскопе (НИФ) 1 .Однако известный способ недостаточно точен, так как в срезах тканей или мазках, полученных из тканей больного, препятствием к реакцииНИф являются фиксированные в тканяхиммуноглобулины, блокирующие соответствующие искомые детерминаты антигена. Наличие же блокирующих агентов обуславливает недовыявление искомого антигена, что даже в случаеприсутствия антигенной субстанциивозбудителя туберкулеза в исследуемом патологическом материале онане дает специфического свечения, чтонеизбежно ведет к ошибкам в диагкостике, и туберкулез остается кеидектифицированкым там где он присутствует, Кроме того, последовательноедвухэтапное нанесение специфическихиммунных сывороток на исследуемыйпрепарат требует дублирования такихманипуляций, как иккубирование, промывка и нысушинание препарата, чтоделает осуществление способа белее40громоздким,Цель изобретения - повышение точности диагностики.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу диагностики.туберкулеза, включающему приготовле 45кие гистологического препарата. нанесение на него в равных объемах специфической нелюмннесцирующей иьиуннойсыворотки и люминесцирующей сыворотки против глобулинов того животного,от которого получена нелюминесцирующая сыворотка, препарат последователь.ко обрабатывают неразведенным 2-меркаптозтанолом и 0,13-ньм растворомпепсина, а нелюминесцирующую и люми-кесцирующую сыворотки вносят в видесмеси, имеющей концентрацию антител2:1 соответственно. 1008 2П р и м е р 1. Больной Т 42 года. Поступил с жалобами на боли в левом боку, одышку, кашель. Заболел остро в апреле, температура повысилась до 38 . Появились боли в боку.оДиагностирована пневмония, при пункции жидкости ке получено. Рентгенологически н левой половине грудной клетки в задне-наружном отделе обнаружена интенсивная овальная тень с выпуклым двойным контуром. Установили левосторонний осумкованный плеврит. Реакция Манту с 2 ТЕ отрицательная. Аспирационная пункция плевры: определены лимфоциты, меэотелиальные клетки. Больному произведена плевробиопсия: гистологичесхи определены участки фиброзированкой плевры с элементами продуктивного неспецифического воспаления с преобладанием гистиоцтов, заключение - хронический неспецифический осумкованный плеврит,В целях подтверждения неспецифической этиологии заболевания на мазках-отпечатках плевры больного была поставлена реакция непрямой иммунофлюоресцекции (реакция НИФ) предложенным способом. Для этого берут три мазка, один опытный и два контрольных. Опытный мазок помещают в неразведенный 2-меркаптоэтанол так, чтобы последний полностью покрыл мазок и выдерживают в течение 10 мин при 4 С, после чего вьюсушенный препарат помешают аналогичным образом в 0,1-ный раствор пепсика и выдерживают в кем в течение часа при комнатнок температуре. Затем ка высушенный аппарат накосят заранее приготовленную смесь специфических иммуккых сывороток и инкубируют обработакной таким образом мазок в течение 30 мин при 37 С. После чего мазок промывают цодопроводной водой, высушивают ка воздухе при комнатной темперутуре и просматривают в люминесцентном микроскопе. При этом наблюдали специфическое (изумрудно-зеленое) снечекие по периферии клеток, на основании чего сделали заключение о присутствии туберкулезного возбудителя в исследуемом материале, Окончательный клинический диагноз; туберкулезньп осумкованный плеврит. Одновременно для контроля специфичности реакции второй (контрольный) мазок обрабатывают смесью нормальной кро45 50 55 личьей сыворотки и люминесцирующей промышленной сыворотки против глобулинов кролика. При наблюдении мазка в люминесцентном микроскопе отмечали отсутствие специфического свечения. Для контроля самой промышленной сыворотки третий (контрольный) мазок обрабатывают только промышленной люминесцирующей сывороткой. При просмотре мазка в люминесцентном микроскопе отмечали отсутствие специфического свечения. В дальнейшем биопроба с плевральной жидкостью больного оказалась положительной, что подтвердило туберкулезную этиологию заболевания. Диагноз был также подтвержден динамическим наблюдением за больным и положительным эффектом от противо- туберкулезного лечения.В данном случае предлагаемым способом была проведена дифференциальная диагностика туберкулеза и неспе"цифического воспалительного заболевания легких.П р и м е р 2. Больная П., 20 лет. Перенесла острое респираторное заболевание с субфибрильной температурой по вечерам. К врачу не обращалась. При флюорографическом обследовании выявлены изменения в легких. Была госпитализирована с диагнозом диссеминированного туберкулеза легких. Противотуберкулеэное лечение эффекта не дало. В дальнейшем проводилась дифференциальная диагностика между туберкулезом и саркоидозом Бека. При рентгенотомографическом обследовании в обоих легких диффузия мелкоочаговая диссеминация, незначительная деформация рисунка и его избыточность. Предполагается саркоидоз Бека. Реакция манту 2 ТЕ отрицательная, Бронхоскопически: изменения со .стороны бронхиального дерева не выявлены. Пункция внутригрудных лимфатических узлов нерезультативна: в пунктате кровь, лимоидные элементы. В промывных водах бронхов микробактерии туберкулеза методом посева не выявлены. Больной был проведен торакоцентоз с биопсией правого легкого; в мазках-отпечатках легкого цитологически обнаружены единич. ные эпителиоидные клетки, гистиоциты. макрофаги. Данная цитограмма не позволила убедительно высказаться в пользу саркоидоза.В целях дифференциации туберкулеза и саркоидоэа больная быпа обсле 1 О 15 20 25 30 35 40 дована предлагаемым способом. Дляэтого берут три мазка-отпечатка изплевры, один опытный и два контрольных. Опытный мазок помещают в неразведенный 2-меркаптоэтанол и вьдержиовают в течение 10 мин при 4 С, послечего высушенный препарат помещаютв 0,17-ный раствор пепсина и вьдерживают в нем в течение часаЗатемна высушенный препарат наносят смесьспецифических иммунных сывороток иинкубируют обработанный мазок в течеоние 30 мин при 37 С. После чего мазок промывают водопроводной водой,высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. При этом специфического свечения не наблюдали. В двухконтрольных мазках свечение такжеотсутствовало. На основании этоготуберкулез был исключен. Несколькопозже гистологические исследованияпоказали наличие в биопсированнойткани легкого полей фиброэа с единичными эпителиоидно-клеточными гранулемами в стадии фиброзированиябез казеоза. На основании результатов обследования больной предлагаемым способом и предположительныхданных морфологического исследованиябольной окончательно выставлен диагноз: саркоидоз Бека, легочная форма,В дальнейшем диагноз был подтвержденположительным клинико-рентгенологическим эффектом гормональной терапии:значительное рассасывание очаговыхтеней, улучшение общего состояниябольной.В данном случае предлагаемымспособом была проведена дифференциальная диагностика между туберкулезом и гранулематозным заболеванием - саркоидозом Бека,П р и м е р 3. Больной К., 43 года, При флюорографическом обследовании выявлены изменения в 52 правого легкого. С диагнозом; опухоль верхней доли правого легкого был госпита лизирован. При рентгенотомографическом обследовании в верхней доле, правого легкого на границе 51 и 5обнаружен округлый однородный очерченный фокус р,2,5 х 2 см с тяжистым верхнемедиальным контуром. Трахея, главные и устья долевых бронхов проходимы. Природа патологического образования не ясна. В условиях искус ственного пневмоторакса проведена пункционная биопсия. В пунктуате:цитологически опухолевые клетки невыявлены, определяется бронхиальныйэпителий, макрофаги, единичные лимфоциты. В мокроте и промывных водахбронхов микробактерии туберкулеза 5методами бактериоскопии и посева необнаружены. Опухолевые клетки в мокроте и промывных водах бронхов невыявлены. Вольному была произведенаторкаотомия с торакоцентезом справа,биопсией легких с дренированием плевральной полости. Гистологическив пределах биопсированной тканиучастки плевро-пневмосклероза, очаговые лимфоидноклеточные инфильтраты,15альвеолит.Цитологически: в мазках-отпечатках легкого обнаружены гистиоциты,макрофаги, лимфоидные элементы,В целях дифференциации туберкулеза и злокачественной опухоли больнойбыл обследован предлагаемым способом,Для этого берут мазки-отпечатки легких, один опытный и два контрольных,Опытный мазок помещают в неразведенный 2 - меркаптоэтанол и выдерживаютв течение 10 мин при 4 С, после чеговысушенный препарат помещают в 0,1 ннй раствор пепсина и выдерживаютв нем в течение часа. Затем на высу- ЗОшенный препарат наносят смесь специФических иммунных сывороток и инкубирушт обработанный таким образоммазок в течение 30 мин при 3 С. После чего мазок промывают водогроводной водой и просматривают в люминесцентном микроскопе, При этом наблюдали яркое специфическое внутриклеточное свечение. В двух контрольныхмазках свечение отсутствовало. Иаосновании результатов обследованиябольного предлагаемым способом и данных клинико- рентгенологического обследования больному выставлен окончательный диагноз: туберкулема легко го. Впоследствии больной был прооперирован и гистологически диагноз былподтвержден: гомогенная солитарнаятуберкулема легких.В данном случае предлагаемым способом была проведена дифференциальная диагностика между туберкулезом и опухолью легкого (онкозаболеванием).При этом, специфическую, не меченную люминесцирующим красителем, сыворотку к микобактериям туберкулеза получают от кролика по общепринятой методике. Вторая же сыворотка против глобулинов кролика, меченная люминесцирующим красителем, выпускается промышленным способом.Смесь указанных сывороток приготавливают следующим образом.К специфической нелюминесцирующей сыворотке микобактериям туберкулеза, полученной от кролика в разведении, равном двойному титру, добавляют в эквивалентном количестве промышленную сыворотку с люминесцентным красителем в разведении, равном одному титру, после чего полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при 3 С, Приготовленная таким образом смесь сохраняет свои реактивные свойства в течениедней. Это позволяет с учетом планируемых лабораторных исследований приготовить необходимое количество сывороточной смеси на неделю. Например, если в течение недели проходят обсг;едование 24 больных, а на одного больного расходуют 0,5 мл смеси (0,25+0,25), то общий объем одноразово приготавливаемой смеси составляет 12 мл, Если рабочее разведение промышленной сыворотки составляет, например 1:32, то получаемую нелющ несцирующую сыворотку к микро- бактериям туберкулеза берут в разведении 1:16.Концентрация пепсина в растворе в том виде, в каком она указана в формуле изобретения, выбрана на основании данных, полученных экспериментальным путем (табл. 1).Как видно из табл. Р 1, концентрация 0,1 -го, раствора пепсина является самой оптимальной, при которой во всех заведомо положительных случаях получено специфическое свечение.В табл., 1 приведены испытания разг.ичных концетраций пепсина. Соотношение специфической иммунной сыворотки к микробактериям туберкулеза и люминесцирующей сыворотки при 2:1 получено на основании экспериментальных данных (табл. 2).Как видно из табл. 2 соотношение участвующих в реакции сывороток в величине 2,"1 является самым оптималь"ным. при котором во всех заведомо положительных 50 :,:.:учаях полученовнутриклеточноз свечение.Предложенный способ в целях дифференциальной диагностики был апробирован у 50 больных, у которых диагноз туберкулеза стоял под вопросом.121008 8таты у 4 больных, а предлагаемый способ у 19, т.е, в четыре раза чаще.Среди обследованных 50 больных туберкулезный процесс с различной степеньюактивности бып окончательно клинически диагностирован на основании тесттерапии у 30 больных. Цитологическоеже подтверждение диагноза туберкулеза было получено всего у 6 больных.10 Таким образом, частота выявленияспецифического антигена туберкулезапредлагаемым -способом в 5 раз превышает известную реакцию НИФ и в 3 раза превышает частоту выявления при 15 цитологическом исследовании.Предлагаемый способ являетсяэффективным высокоинформативным диагностическим тестом и может быть рекомендован для широкого внедрения 20 в практику фтизиатрических учреждений. Материалом для исследования служили: мазки-отпечатки биопсированной ткани (легких, плевры, лимфоузлы) - 16 больных, пунктаты из плевральной полости - 9 больных, соскобы из бронхов - 26 больных. Изучаемый материал подвергали цитологическому анализу параллельно с исследованием классической реакцией НИФ, т.е. известным и предлагаемым способом, Результаты проведенных исследований представлены в табл. 3.Как видно из таблицы, реакция непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) была положительной лишь в случаях, когда имел место туберкулезный процесс,. в том числе.и в сочетании с неспецифическими заболеваниями, что свидетельствует о высокой специфичности реакции НИФ. Известный вариант НИФ. дал положительные резульТаблица Результат Концентрация, Х Из 50 заведомо положительных мазков флюоресценциянаблюдается в 12 мазках. 0,05 0,1 0,2 Свечение не дифференцируется. 0,3 Таблица 2 Соотношение сывороток Результат Специфическая цельная и люминесцирующая цельная - 1:1 Флюоресценция в 20 из 50 заведомо положительных препаратов.Из 50 заведомо положительныхмазков внутриклеточное свечениев 50.Из 50 заведомо положительныхмазков флюоресценция в 20. Специфическая в двойном. титреи люминесцирующая в титре - 2:1 Специфическая вчетырехкратном титре и люминесцирующая в титре4:1Специфическая в титре, алюминесцирующая в двойном титре - 1:2 Специфическая в.титре, алюминесцирующая в четырехкратном титре -1:4 Диффузное свечение всего препарата Диффузное свечение всего препата БНИИПИ Заказ 7841/5 Тираж 687 По свое Филиал ППП Патеит , г.Уагород, уп.Проектная, 4 Из 50 положительных мазков флюоресценция клетокнаблюдается во всех 50 мазках.Из 50 заведомо положительных мазков флюоресценциянаблюдается в 10 мазках.