Способ получения комплекса внеклеточных ферментов

(19) (1 А 3(51) С 12 Б 9/02,14,. повышения акти также упрощени соба, в качест используют агр водства фурфур лолигнин и сво соотношении 42 Даниляк%. ч а лью получ нта перок нисид роводятостнойагримус в к отли-с цельюфермента льтиазовани использоации 4,0 ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТ СС(56) 1, Авторское свидетельство СССР Р 654679, кл. С 12 Н 1/16, 1979.2. Авторское свидетельство СССР Р 747886, кл. С 12 Н 1/00. 1980, (54)(57 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий культивирование продуцентовгрибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением грибного мицелия от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью вности комплекса, ая и удешевления спове источника углеродаимус - отход произола, содержащий целбодный фурфурол в: 1, в количестве 0,52. Способ по и. 1, ощ и й с я тем, что, с ця преимущественно фермазы, культивированиепутем образования поверхпленки при использованиионцентрации 1,0-2,5%.3. Способ по пп. 1 ич а ю щ и й с я тем, чтполучения преимущественнмонофенол-монооксигеназывирование проводят путемповерхностной пленки приванин агримуса в концент5,0%,1084299 гсоотношении 42:1, в количестве 0,55,07.Кроме того, с целью полученияпреимущественно Фермента пероксидазыкультивирование проводят путем обра.зования поверхностной пленки прииспользовании агримуса в концентрации 1,0-2,57,С целью получения преимущественнофермента монофенол-монооксигеназы,культивирование проводят путем образования поверхностной пленки прииспользовании агримуса в концентрации 4,0-5,0 .Агримус представляет собой многотоннажный отход, полученный припроизводстве фурфурола из стержнейпочатков кукурузы, который частичноиспользуют как лигноцеллюлозноеудобрение в сельском хозяйстве.П р и м е р 1. Готовят питательную среду следующего составаИ Н 4 НгР 04 2,0КНР 04 0,6К уНРО 4 0,4мяо 4 0,5Агримус 5,0Водопроводная вода 1 л.Приготовленную таким образом средуавтоклавируют, охлаждают и засеваютчистыми культурами базидиомицетовРУецгоцз озггеаСцз (Рг.) Кцппп. ИИВР 1300.или Сог 3.оУцз чегзсоУог (Рг.)Яцек.087. Культивирование проводятв глубинных условиях на качалке,в колбах Эрленмейера в течение 7 сут.при 28 С. Изобретение относится к микробиологической промышленности, вчастности к способам получения ферментов, продуцируемых базидиомицетами. 5Известен способ культивированиябазидиомицетов на питательной среде, содержащей источник углерода иминеральные соли, а также отходыпроизводства Ц .1 ООднако данный способ не позволяетполучить широкий спектр продуцируемыхферментов,Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому эффекту 15к предлагаемому является способполучения комплекса внеклеточныхФерментов, предусматривающий культивирование продуцентов-грибов базидиомицетов на питательной среде, 20содержащей лигнинсодержащие отходыв качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последующимотделением грибного мицелия от культуральной жидкости, содержащего вне" 25клеточные Ферменты 21,К недостаткам этого способаотносятся сложность технологии его. осуществления и значительные затраты времени и средств. Кроме того, способЗО ограничивается использованием единственного штамма дереворазрушающего гриба. В нем использован недостаточно широкий ассортимент лигнинсодержащих отходов и получаемых при этом продуктов биосинтеза микроорганизмов, в частности внеклеточных Ферментов, обладающих недостаточно высокой активностью.Цель изобретения - повышение 4О активности комплекса ферментов, а также упрощение и удешевление способа.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения 45 комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающему культивирование продуцентов-грибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве 50 источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением гриб. ного мицелия от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, в качестве источника угле" 55 рода используют агримус-отход произ. водства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в Для сравнения в качестве контроля выращивание указанных базидиомицетов проводят также в аналогичных условиях на питательной среде, содержащей вместо агримуса целлюлозу (фильтровальную бумагу) в количестве 15,0 г/л.В табл. 1 и 2 приведены результаты измерений активностей внеклеточных пероксидазы (Кф 1.11,1.7), монофенол-монооксигеназы (Кф 1. 14.18. 1), Эндо,4-3-глюканаэы (КФ,3.2.1.4), полигалактуроназы (КФ 3.1.1,15), экзополигалактуроназы (Кф 3,2.1,67) и пектинэстеразы (Кф 3.1111) в культуральных фильтратах указанных продуцентов, полученных после отделения мицелия и остатков твердого субстрата. По сравнению с контролем среда с агримусом более эффективна для получения большинства3 1084299исследуемых ферментов. Так, привыращивании Р 2 ецгогцз озггеагцэ насреде с агримусом достигнуто увеличение активности пероксидазы и моно"фенол-монооксигеназы, более чем в12 раз по сравнению с контролем.П р и.м е р 2. Готовят питательную среду по примеру 1, которуюзасевают чистыми культурами базидиомицетов РРецгогцэ оэггеагцэ (Гг.) 10Кцшш. ИМВГ, Гцпа 1 ха ггод 1(Вегас.) Вопд ег. 81 пя БИНилиОхурогцэ оЪццсепз (Гг.) РопК.ИБК.В отличие от примера 1 культивирование проводят в стационарных условиях методом поверхностной пленкив течение 10 сут при 28 С.оДля сравнения в качестве контроля выращивание указанных базидиомицетов проводят также в аналогичных 2 Оусловиях на питательных средах,содержащих вместо агримуса целлюлозу(фильтровальную бумагу) в количестве15,0 г/л или экстракт из свекловичного жома в количестве 100 мл/л. 25В табл. 3 приведены результатыизмерений активностей внеклеточныхпероксидазы и монофенол-моноксигена-.зы в культуральных фильтратах укаэанных продуцентов, полученных после ЗОотделения мицелия и остатков твердого субстрата. На среде с агрнмусомактивность обоих ферментов згачительно выше, чем в контрольном варианте.Так, для культуры Р 2 ецгогцэ оэггеа 35гцэ активность пероксидазы на средес агримусом составляет 18,6 ед/л,тогда как в контроле с целлюлозой обнаружены следы активности этого фермента, на среде с экстрактом из свекловичного жома активность пероксидазы составляет 14,2 ед/л,П р и м е .р 3. Готовят питательную среду по примеру 1, в которую в качестве единственного источника углерода вводят агримус в количествах 5,0-50,0 г/л. Указанные среды засевают чистой культурой базидиомицета РУецгогцэ озггеагцэ (Гг.) Кцпал. ИМВГ, Культивирование проводят в стационарных условиях методом поверхностной пленки в течение 10 сут при 28 С. В табл. 4 приведены результаты измерений активностей внеклеточной пероксидазы и монофенолмонооксигеназы- в культуральных фильтратах, полученных после отделения мицелия и остатков твердого субстрата.Из табл, 4 видно, что наибольшая активность пероксидазы культуры гриба Р 2 ецгогцз оэггеагцэ - 56,2 ед/л при концентрации агримуса 1,0 Е, а наибольшая активность монофенол-монооксигеназы - 56,0 ед/л при концентрации агримуса в среде 4,07. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить активность ферментов получаемого комплекса в 12 раз, а также упростить и удешевить способ за счет использования отходов производства. Ед/изм Фермент Вариант . Х активности с целлю- по отношению лозой к контролю) (контроль) Субстрат Вариантс агримусом 1244 ед/л 0,9 Бензидин Пероксидаза Монофенол- моноокси- генаэа 1285 0,7 9,0 Бензидин Эндо,4-(3 глюканаза 7 деполимеризации Натриевая соль карбо- ксиметил- целлюлозы 203,5 19,9 40,5 Т а б л и ц а 1Активность внеклеточных ферментов Р 1 ецгосцэ оэсгеагцэ (Гг.) КцшшИМВГпри глубинном выращивании на агримусе и целлюлозе.3 д/мл Экзополи- галактуро Пектова кислота 0 0,5 51 а Пектинэст е высокометоксили а 200,0 0 рованны ТаблАктивность внеклеточных Ферментов Согойиз087 при глубинном выращивании на агримусе и гзхсоРог (Рг.) Ццееллюлозе Ед.изм бстрат Фермент Вариант Х активнос с целлю- по отношен лозой к контролю онтроль 159 е ензидин ероксидаза енз 1,9 3 Эндо,4- глюканаза Ж де имериации 64,72,0 озы Нолигалактуроназа 65,76 ед ктовая Экзополи лактурон мл. О,л ислот Пектинэсраза 5 4,О МоноФенолмонооксигназа Натриевая соль карб ксиметилектинвеклоый Пектин.высокометоксилированный Ед/изм Вариантс агри- мусом Вариан с агри- мусом Вариантс целлюлозой1084299 Т а б л и ц а 3Активность виеклеточных ферментов базидиомицетов при выращиванииметодом поверхностной пленки иа агримусе, целлюлозе и экстрактеиз жома Фермент Субстрат Ед.изм,Вариантс агримусом Р 1 ецгоцв овггеаГцв (Рг.) КцпддддПерексидаза Бенэидин едл 18,6 ИМВР300 Следы14,2 Монофенолмонооксиге 18,0 Следы 13,0 наэа РцпаБа гго 8 дд. (Вегк) Воп 4. ег. Яапа БИН14,0 Следы 8,0 Пероксидаза 3,9 10,0 Следы Охурогцв одоцсепв (Рг.) РопК ИБКи 6,0 14,6 Пероксидаза Следы 5,0 Следы Следы Таблица 4 Активность внеклеточных ферментов Р 1 ецгойцв овггеагцв (Рг) Кщшп ИМВРпри выращивании методом поверхностной пленки в зависимости от содержания агримуса в питательной среде Ед,изм, Содержание агримуса (вес,7) Субстрат фермент 0,5 1,0 2,5 4,05,0 едл 18,6 56,2 42,2 46,4 28,0Ю Пероксидаза Бензидин Монофенол- монооксиге"1- 17,5 20,0 40,0 56,0 31,0 каза ВЯИИПИ Заказ 1926/19 Тираж 522 Подписное 1 филиал ППП "йвтептн, г, Ужгород,ул.Проектная, 4 Монофенолмонооксигеназа Монофенолмонооксигеназа Вариант сцеллюлозой