Способ выращивания ортомиксовирусов

аю 80 ао СОЮЗ СОВЕТСКИХСКИХРЕСПУБЛИК ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,Н АВТОРСКОМУ СВИДЙТЙЛЫТВУ с ГОСУДАРС;ГВЕННЫЙ КОМИТЕТ ОООРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРИТЮ(71) Институт микробиологии и вирусологии ЛН Казахской ССР и Казахский ордена Трудового Красного Знамени государственный университетим. С М,Кирова(56) 1. Заявка Великобритании9 1279859, кл. С 6 Е, 1961,2. Авторское свидетельство СССРУ 610864, кл. С 12 М 7/00, 1977(прототип),зао . с 12 и 7/оо// с 12 и 7/оо; С 12 В 1/,91(54) (57) спосоБ выРлцивАния оРтоиик: СОВИРУСОВ в среде культивирования в, присутствии стимулятора репродукции вирусов, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повьппения выхода:вирусов, в качестве стимулятора ре;продукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацетилбутан йли нитрозометилмочевину в концентрации 1- 25 или 1-20 мкг/мл соответственно, при зтом вирусы обрабатывают стимулятором до внесения в среду культивирования.1081208 ТаблицаКратность повьппения50ЭИД 50 КонцентрацияДАБ;"мкг/мл Экспозиция,ч Титр РГА Штаммы Конт- Опытроль Конт- Опыт роль ВПЧ 40 512 1024 8,3 1024 8,3 2048 8,3 4096 8,3 4096 8,3 2048 8,3 512 8,3 1024 7,6 1024 7,6 9,9 20 512 63 10,1 16 512 398 10,9 14 512 794 11,2 512 631 О 100 512 1 О., 3 512 8,9 512 9,32 20 512 9,8 39 1Изобретение относится к вирусологии и касается способа выращивания ортомиксовирусов,Известен способ зыращивачия вирусов в присутствии стимулятора репродукции вируса, в частности полисахаридов, продуцируемых ЕзсЬег 1 сЬа со 11, выращенной в условиях лимитирования по лизину .1, ф 0Известен также способ выращивания ортомиксовивусов в среде культивирования в присутствии стимулятора репродукции вирусов - липидных экстрактов печени и почек крыс2 3. 5 Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода вирусовЦелью изобретения является повышение выхода вирусов,20Указанная цель достигается тем,что согласно способу вйращиванияортомиксовирусов в среде культивирования в присутствии стимулятора репродукции вирусов, в качестве стимулятора репродукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацетилбутан илинитрозометилмочевину в концентрации1-25 или 1-20 мкг/мл соответственно,рри этом вирусы обрабатывают стимулятором до внесения в среду культивирования.Способ осуществляют следующим образом.1 П р и и е р 1. Вирусы гриппа, штамм ЮБЯ и штамм Вейбридж(ВПЧ ) раз-. множают в хорионаллантоисной полости 10- дневных куриных эмбрионов. Вирус перед заражением обрабатывают 1,4-бис-диазоацтилбутан ( ДАБ ) в конечной концентрации 25 20, 16, 14, 12, 10 и 1 мкг/мл. Навески ДАБ раст воряют в фосфатном буфере с рН 6,0, соединяют с суспензией вируса и инкубируют при комнатной температуре, периодически встряхивая. Контакт вируса с ДАБ длится 1 и 2 ч. Затем обработанный и необработанный вирус титруют до 1 О " и по 0,2 мл ЧЗН и 0,1 мл ВПЧ каждого разведения вводят в аллантоисную полость 10-11 дневного куриного эмбриона. Через 48 ч ЧЯМ и 24 ч ВПЧ инкубации при 37 С эмбрионы вскрывают и по характеру агглютинации эритроцитов на дне пробирки судят о наличии вируса. Гемагглютинирующую активность учитывают по реакции гемагглютинации на плексигласовых пластинках с куриными эритроцитами. Инфекционные титры вируса рассчитывают ло методу Рида и Менча и выражают в РЭИД . О стимуляции репродукции судят йо соотношению титров ннфекционности обработанного и необработанного вируса, Результаты влияния ДАБ на размножение ортомиксовирусов в куриных эмбрионах приведены в табл.1.1081208 Продолжение табл.Е ЭИД Кратность повышения КонцентрацияДАБ Экспо Титр РГА Птаммы зиция чонт- О гк/мл 512 2048 512 2048 512 2048 0 51 14 631 50 12 7,6 12 1024 8,а б л и ц а Тит 50 Кон центммы рация111вмк г /мл КратностьповышенияЭИДЭкспозиция,ч Конт- Опгт он ыт ол 0 512 1 512 8,7 04 0,0 9 12 204 20,0 1024 9,3,0 20 04 8,204 2 512 0 512. 8,9 1024 2,5 Ъ. тОбработка вируса низкими концентрациями ДАБ повышает репродуцируе- мость инфекционного вируса. Наиболь ший эффект наблюдается при обработ ке 14 мкг/мл ДАБ в течение 2 ч, когда выход вируса увеличивается в 794 ВПЧ и 631 Н 5 М раз.П р и м е р 2. Вирусы штаммов 25 И 1 и ВПЧ культивируют аналогичным образом, а обработку проводят нитКонт- Опы роль ,6 10, ,6 10,4розометилмочевиной в концентрации Ь20, 10, 5 и 1 мкг/мл. Контакт виру, са с НМИ длится 0,1 и 2 ч при комнатной температуре и периодическом встряхивании. Дальнейший ход экспериментов с обработанным и необработаннымФ вирусом сходен с примером 1.Результаты влияния НИИ на размножение ортомиксовирусов в куриных эмбрионах приведены в табл,2,1081208 И.одолжение табл. Титр РГА Экспозицияч Кратность повышенияЭИД .р КонцентрацияДАБ,мгк/мл Штаммы Опыт Конт- Опыт роль,4 1024 16,0 8,6 7,4 2 512 31,6 8,9 2048 0 10 13,0 7,4 2048 25,0 8,8 7,4 512 6,3 8,2 512 0 512 8,0 512 512 12,6 8,5 1024 2 512 0 512 1 512 2 512 7,4 512 3,2 1024 4,0 1024 8,0 7,4 Т а б л и ц а 3 БОЕ/мл КонцентрацияДАБ,мкг/мл Экспозиция, ч Кратностьповышения,БОЕ/мл Штаммы Вирус не Вирус обраобработан ботан 12,2 10 1,3 10 2,0 10 5,2 " 10 1,4 ф 10 ВПЧ . 25 234,6 20 92,9 1,4 " 10 16 142,8 аибольший стимуляционный эффект обнаружен при обработке 10 мкг/мл НИМ в течение 2 ч, когда выход вируса превышается в 32 ВПЧ и 25 ИИ раз.35 П р и м е р 3. Вирусы штаммов ИИ и Вейбридж размножают в культуре клеток куриных фибробластов. Обработку вируса проводят ДАБ в кон- , 4 р центрации 25, 20 и 26 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая.Двухсуточные культуры куриных фибробластов в матрасах объемом 45 мл заражают по 0,5 мл соответст-, , вуюших разведений обработанного и необработанного вируса, выдерживают при комнатной температуре 1 ч, Затем инокулянт удаляют, а клеточный пласт промывают раствором Кэнкса и покрывают средой 199 с 1,83 агаром Дифко инкубируют при 37 оС в течение 3 - 5 сут и подсчитывают количество бля.шек, Титр вируса выражаешься в единицах бляшкообразования (БОЕ/мл ).Результаты влияния ДАБ на репродукцию ортомиксовирусов в культуре куриных фибробластов приведены в табл.3./мп б, 20 и 25 мк температуре, и хивая. Дальнейшн с обработанным русом сходен сНИМ в концентрации2 ч прн комйатнориодически встря,4 10 ,410 13,3 2 1,2 210 2 510 107 2 3, 10 е бнаруже гда бля 200-800 раэ в зависимости от клеточной системы, используемой для выращивания вирусов (по известному спо-. :обу в 5,4 раза), снизить трудоемкость эа счет приготовления стимуляторов из коммерческих препаратов, полностью исключить вероятность внесения бактериального загрязнения в среду культивирования вирусов. Максимальный в концентрации кообразующая сп вирусов превыша разффект НММ мкг/мл, к обность из контроль 0-21 о Составитель ,",Сми ехред Т,дубинчак в ор Н Рогули енко е ректо ПодписиСР аказ 1478/23 Тираж 522 ВНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская н, д. 4/5 жгород, ул. Проектная, 4 тент" иал ППП Обработка вируса низкими концент :рациями ДАБ повышает выход вируса и в условиях заражения культуры клеток. Наибольший эффект ДАБ окаэывае в концентрации 25 мкг/мл прн экспозиции 2 ч. Бляшкообразующая способность такого вируса превышает контроль в 234 ВПЧ и 304 ИМ раза.П р и м е р 4, Вирус получают аналогичным образом, обрабатывают ВПЧ 25 2 1,Использование предлагаемого с соба выращивания ортомиксовирусо позволит. увеличить урожаи вируса 1 таты влияния НММ на репротомиксовирусов в культуреибробластов приведены в