Полипептид, обладающий способностью уменьшать содержание кальция в сыворотке
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
-61 у;-тр-ту ггр-бв, - ну 8-тгр-рве-рто- Фп 26ра, Таданори ава (Япония) ики Кайсяу-А 18-Ую 0-ЗНе Ф 0 цоп О стью снижат в сыворотке обладакщий спосо содержание кальц 14,197.апд Ра 1 Ьо 1 оД. С 11 п. 1 п3. Шредедыф Ч. Х, И УДЯРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛЯМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВтоскО свиДЕТЕЛь(7 Я Тойо Дэозо КабуИзобретение относится к синтезу нового соединения - полипептида, обладающего способностью уменьшать содержание кальция в сыворотке, который может найти применение в биологии и медицине. 5Известен человеческий кальцитонин, обладающий способностью уменьшать содержание кальция в сыворот" ке Ь 1 .Человеческий кальцитонин характеризуется наличием дисульфидной связи, которая крайне нестабильна и легко разлагается или полимериэуется, кроме того, его стабильность как фармацевтического соединения мала.Цель изобретения - расширение арсенала средств воздействия на живой организм.Поставленная цель достигается предлагаемым полипептидом Формулы 2 О где к - реактивный сложноэфирныйостаток,вводят в реакцию образования кольцаО на любой стадии конструирования пептидной единнцы 1 а защитную группудля реактивной группы удаляют налюбой стадии реакции. Продукт можетбыть превращен в его соль присоединением кислоты или комплекс,Защитные группы для синтеза исходных материалов или промежуточныхпродуктов представляют собой обычные защитные группы, используемыепри синтезе пептидов, и могут бытьлегко удалены путем гидролиза, кислотного разложения, восстановления,аминолиза или гидразинолиза.Предлагаемый полипептид можетбыть получен в виде свободного основания или в виде его соли. Свободное основание может быть обычнымобразом превращено в его соль. Сво"бодное основание может быть превращено в его фармацевтически приемлемую соль при взаимодействии с неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводороднаякислота, серная кислота, или фосФорная кислота, или с органическойкислотой, такой как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионоваякислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота,щавелевая кислота, янтарная кислота,яблочная кислота, лимонная кислота,4 О винная кислота, бензойная кислота,салициловая кислота, низшая алкансульфокислота, беизолсульфокислотаили толуолсульфокислота.В описании использованы следую 45 щие сокращения:ВОС;трет-бутоксикарбонилСвк: бензилоксикарбонилВх 1: бенэилВ 1 г,С 2)з дихлорбензил5 О ОЕев ЭТИЛОВЫЙ СЛОЖНЫЙ ЭФИРОВк 1: бензиловый сложный эфирБег:Ь серииЬец:Ь лейцйнЧа 1:Ь валин55 АгК:Ь аргининА 1 а:Ь аланинЬу 5;Ь лизинС 1 ц;Ь глютаминовая кислотаТуг:Ь тирозинРпе:Ь-фенилалаяинТФК: трифторуксусная кислотаЦГА: циклогексиламинТГФ: тетрагидрофуранАсОЕе: этилацетатЮС:М-этил -И-диметиламинопропилкар 65 бодиимид )-ле-Рц - еа 1- е 1 е - .а 1 а - зга 2 ене е ааетдеп,обладающим способносты. снижать содержание кальция в сыворотке.В предлагаемом полипептиде Ь-Суэ в 1-м и 7-м положениях заменен Е-пробковой кислотой:НООС (СН,)- СН-ЗН.,1,СООЕкарбоксиЛьная группав ы -положении связана с глициномс образованием циклической структуры.Предлагаемый полипептид обладает высокой химической стабильностью и в 10 раз превосходит по биологической активности человеческий кальцитонин. Поскольку предлагаемый кальцитонин имеет ту же последовательность аминокислотчто и человеческий Ьс 11-го по 32-й фрагмент 3 то он является иммунологически идентичным с природным человеческим кальцитоннном и, следовательно, фармацевтически безопасным и не имеет перекрестной иммунности со свиным или лососевым кальцитонином 2 .Синтез предлагаемого соединения может быть осуществлен с помощью обычного метода синтеза пептидов ЬЗ 3, т.е, аминокислоту и/или пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, вводят в реакцию конденсации для получения заданной последовательности аминокислот и конструкционную единицу, . включающую следующую последовательность аминокислот формулы:1028662 растворителей и после этого помещают в верхний слой указанной смеси растворителей, Элюирование проводят тем же верхним слоем, фракционируя каждые б г фракции, активные фрак" ции5-14-я трубки ) собирают и лиофи- з лизируют; Полученный таким образом порошок повторно хроматографируют в тех же условиях на Сефадексе Си лиофилизируют. Лиофилизированный активный порошок растворяют в 1 М 10 уксусной кислоте, выливают в колонку с Сефадексом ЬН(2,2 х 137 см), элюируют 1 М уксусной кислотой на фракции по 5 г. Активные Фракции объединяют и лиофилизируют, получа ют 29,7 мг продукта (1000 МКСБ /мг).Й = 0,82 (носитель: Мерк целлюлоза, проявитель:и-бутанол:уксусная кислота:вода:пиридин 15:3:12:10),Ру = 0,43 (носитель:Иерк целлю" щ лоза, проявитель:Н-бутанолфуксусная кислота:вода (верхний слой) 4:1:5)с) = 69,6 (С = 0,72, 1 М уксусная кислота). 25Аминокислотный анализ:Ьуз 1,15/1/, Н 1 з 1,01/1/, Азр 2,94 /3/, Тгр 4,80/5/, Бег 1,06/1/ 61 и 2,14/2/, Рго 1,96/2/, 61 у 4,074/, А 1 а 2,00/2/, Ча 1 0,95/1/. Ме 0,87 /1/, д 1 е 0,96/1/, Ьеп 1,84/2/, Туг 0,96/1/, Рйе 3,18/3/, Й-аминопробновая кислота 1,02/1/. Предлагаемый образец испытан нау активность по понижению кальцияия н Образец для аминокислотного ана" лиза готовят следующим образом. 35Предлагаемай полипептид гидролиэуют б н.соляной кислотой (с добавлением нескольких капель аниэола) при 110 С в течение 45 ч и сушат при пониженном давлении. Осуществлен 40 радиоактивный иммунный анализ человеческого кальцитонина с использованием меченого: (Азп) - аналога человеческого кальцитонина.Материалы и методы, Приготовление 4 антигел. 180 мкг синтетического (Азц) " -ЬСТ (аналог человеческого кальцитонина ), растворенного в 1,0 мл раствора соли, эмульгируют н полном стимуляторе фрейнда (фЕальбиохем") и внодят подкожно трем самкам кролика (2,6-3,0 кг). Иммунизацию прослеживают посредством вспомогательной инъекции на 2,4 и 6-й неделях, На 8-й неделе иммунизации от каждого кролика получают сыворотку, полученные образцы проверяют ва их способность связывать меченый аналог человеческого кальцитонина, Природный синтетический ЬСТ (240- 325 мг) растворяют в "1 мл растнора 6 О соли эмульгируют в полном стимуля" торе и вводят подкожно пяти самкам кролика. Вспомогательную подкожную инъекцию осуществляют на 8 - 12-м месяце, а антитела проверяют на 10 и 16-й неделях. Препараты антител ЫТ были поставлены "4-кальбиохем" и применялись для сравнения. Используют козлиную стандартную сыворотку анти-т-глобулина кролика Фирмы Эйкен Кемикал Ко, ЛТд.Приготовление меченого ЬСТ н аналога ЬСТ. ЬСТ и аналог ЬСТ (2,5- 5,0 мкг) метил Яа " .1 (1,5-3,3 м Ки) по методу оксидазы глюкозы с лактопероксидазой. Выделение меченого пептида из соленого раствора осуществляют с помощью гель-Фильтрации на колонке (0,8 х 25 см) с СеФадексом С, элюируют 1 н.уксусной кислотой. Меченые пептиды проверяют на химическую чистоту дополнительно гель-Фильтрацией на Сефадексе С(1,1 х 57 см . ЭлектроФорез на ацетате целлюлозы (2 х 10 см) осуществляют при постоянном напряжении 20 В/ом (2 мА) в течение 5- 10 мин, используя 0,01 М фосфатный буфер рН 7,4Полученные после гель- фильтрации меченые пентиды хранят при 4 С в уксусной кислоте (1 н,раствора), содержащей 5 альбумина бычьей сыворотки, Удельную активность рассчитывают по отношению радиоактивности пика пептида к радиоактивности пика соли, которую отделяют посредством электрофореза. Соль Иа " 1-коммерческий (Ассоциация Радиоизотопов, Япония). Образец для культивирования. Ти-пичное культивирование проводят в пластиковых пробирках (1 х 7 см) двухступенчатым методом двойной антительной методики. При начальном культивировании 0,1 мл стандартного синтетического ЬСТ для сыворотки и 0,1 мл анти-ЬСТ антител при соответствующем разбавлении (обычно: 1:5000) добавляли к 0,1 мл разбавителя, содержащего 0,037 динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты1 0,5 альбумина бычьей сыворотки и 0,1 азида натрия в соленом растворе Фосфатного буфера (0,01 Му рН 7,4 О,5 М ИаС 1). Смеси культивируютопри 4 С в течение 2 с и затем добавляют 0,1 мл Иа"261- ЬСТ-аналога, достаточного для обеспечения 10000 срм. Через 4 сут после начального культивирования добавляют 0,1 мл козлиной сыворотки анти-у-глобулина кролика (1:40) и 0,1 мл 0,5-ной обычной сыворотки кролика, и через 24 ч реакционные смеси центрифугируют при 3000 об/мин н течение 30 мин. Разбавление всех используемых для испытания материалов осуществляют с помощью раэбавителя.1028662 Составитель З. ВолковаРедактор Т. Веселова Техред Л.Пекарь КорректорО. Билак Заказ 4888/21 Тираж 418 Поцписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР ло делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауыская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. ПрОектная, 4 Сыворотке. Испытания проведены последующей методике. Образец адекватно разбавляют 0,1 н,раствором ацетата натрия -0,1 альбумина Самцам крыс индивидуально внутривенно вводят 0,2 мл соответствующего разбавленного раствора, Через 1 ч всех крыс умерщвляют, собирают кровь и определяют содержание кальция в сыворотке в каждом образце крови с ноуебщью атомной абсорбционной сйектро 4 отомет-.рии. Сравнивая с соответствующим стандартом, определяют активность кальцитонина в образце,На основании Проведенных испытаний установлено, что предлагаемое 5 соединение - (Азц " )" ЕСТ (аналогчеловеческого кальцитонина) - обладаетактивностью (потенциал) 100 ед.МК, С/мг, в то время, как известноесоединение - человеческий кальцито нин (ЕСТ), имеет активность только82 ед. Мй, С/мг, т.е. предлагаемоесоединение более чем в 10 раз активнее известного.
СмотретьЗаявка
2711904, 16.01.1979
ТОЙО ДЗОЗО КАБУСИКИ КАЙСЯ
СУГИНЕИ САКАКИБАРА, ТАДАНОРИ МОРИКАВА, ЯСУО НАКАГАВА
МПК / Метки
МПК: C07K 14/585
Метки: кальция, обладающий, полипептид, содержание, способностью, сыворотке, уменьшать
Опубликовано: 15.07.1983
Код ссылки
<a href="https://patents.su/5-1028662-polipeptid-obladayushhijj-sposobnostyu-umenshat-soderzhanie-kalciya-v-syvorotke.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Полипептид, обладающий способностью уменьшать содержание кальция в сыворотке</a>
Предыдущий патент: Способ получения 4, 8-диамино-1, 5-диоксиантрахинона или его производных
Следующий патент: Аналоги люлиберина, проявляющие ингибирующее действие на ход процессов овуляции у животных
Случайный патент: Храповый останов