Способ отбора веществ-адаптогенов

(61) Дополнительное к авт. свид 22) Заявлено 01,12.75 (21) .2195776(30-15единением заявки-4 1 В 10 с присо Гееуюрственми квинтет СССР3) оритетбликова УДК 61088.8) 01.83. Бюллетеньия описания 28.01.83 пв делам кзебретекик и еткрмтийта опубликован 72) Автор изобретения злам Всесоюзный научно-исследовательский инс незаразных болезней животных 71) Заявител(54) СПОСОБ ОТБОРА ВЕЩЕСТВ-АДАПТОГЕН Изобретение отн а именно к отбору препаратов медици назначения, которь приспособительные ма.кологии, ктивных инарного ащитно- организсится к фармбиохимическиского и ветерповышаютвозможности вийИзвестно ряд способов отбора биохими чески активных препаратов, обладающи биохимической активностью, скрининг в дут на зеленых одноклеточных водоросля Определенное количество химического соединения смешивают с культурой зеленых одноклеточных водорослей. Рост и размножение клеток в опыте сравнивают с таковыми в контроле, При применении данного способа установлено, что вещества, обладающие совершенно различными видами биохимического воздействия, такие как инсектициденты, акрициды, фунгициды или фармацевтические препараты, проявляют активность, которая может быть применена к исследуемому объекту с тем, чтобы определить активность химических веществ по отношению к ферментам, ферментативным системам и генам 1,Известен также способ отбора биологически активных веществ, предусматривающий биохимическую активность таких соединений как гербициды, инсектициды, фунгициды, фармакологические препараты путем контактирования определенного количества химического соединения с культурой одноклеточных зеленых водорослей, сравнивается с помощью электронного счетчика, электроколориметра или нефелометра рост клеток или скорость размножения их с аналогичными величинами для контрольной культуры. Условия развития культуры могут быть изменения за счет изменения состава среды, температуры, подачи газа или интенсивности и продолжительности освещения 2.Наиболее близким к предлагаемому я ляется способ отвора веществ заключающ ся в том, что белых мышей, которым вводят определенные дозы испытуемого вещества (10 животных на дозу и столько же в контроле), подвергают неблагоприятному воздействию (бег, плавание и др.) до и после применения препарата. Контрольным животным вводят растворитель и подвергают тому же воздействию. Препарат оценивает990189 5 1 О 30 35 40 45 50 55 3ся сравнением выживаемости или работоспособности опытных и контрольных животных 13,Основными недостатками этих способов являются следующие: способы отбора биохимически активных веществ (1,2) предусматривают только выявление общей стимулирующей или ингибирующей активности неизвестных или известных веществ. Оценка только на культуре клеток водорослей не может быть безоговорочно перенесена на млекопитающих животных. Изменение условий развития культуры на протяжении всего периода контролирования вещества с клетками может изменить интенсивность их роста, но не выявляет действие препарата на защитно-приспособительные возможности.Способ оценки и изыскания растительных препаратов, повышающих защитно- приспособительные возможности организма, не отвечает задачам массового отбора химических веществ. Он требует больших затрат времени (на отбор 100 препаратов не менее 100 человеко-дней рабочего времени) и средств (на отбор 100 препаратов около 5000 белых мышей). В этом способе применяют одно какое-либо специфическое повреждение, поэтому трудно выявить препараты с неспецифической активностью.Целью изобретения является повышение эффективности отбора веществ-адаптогенов.Поставленная цель достигается тем, что согласно-способу отбора веществ-адаптогенов, включающему введение испытуемого вещества лабораторному животному с последующим определением выносливости организма животного путем сравнения с контрольным животным, перед введением лабораторным животным испытуемых веществ проводят скриминг последних на средах с микроорганизмами с отбором обладающих наибольшим защитным действием веществ,Причем в качестве среды с микроорганизмами используют среду с инфузориями при концентрации испытуемого вещества 1,10- 1.10 на мл при культивировании, в течение 12 - 24 ч при 10 - 22 С.Кроме того, в качестве среды с микроорганизмами используют среду с.дрожжами при концентрации испытуемого вещества 1.10 - 1.10 на мл при культивировании в течение 24 - 48 ч при 28 - 30 С.Пример. В жидкой культуре инфузорий дрожжевых клеток или других свободно живущих клеток делают разведения испытуемого препарата от 1.10 до 1.10 ф и культивируют, например, инфузории в те. чение 12 - 24 ч при 10 - 22 С, дрожжи в течение 24 - 48 ч при 28 - 30 С. Для контроля культивируют клетки без препарата. После этого культуру подвергают повреждающему воздействию и через определенный промежуток времени измеряют время жизни или степень роста и размножения с по 4мощью нефелометрии. По отношению показателей опыта к контролю вычисляют коэффициент защиты. Препараты, показывающие достоверный коэффициент защиты больше 1,000, оставляют для отбора на уровне целого организма.Отобранные препараты вводят белым мышам или другим лабораторным животным внутрь, подкожно, внутримышечно в дозах от 0,1 до 100 мг на 1 кг веса (по 1 О животных на дозу). Контрольным животным вводят растворитель. Через 1-6 ч животных подвергают воздействию небла.гоприятного фактора, например, плаванию .или усыплению наркотиком и другому. Определяют показатель, характеризующий жизне.способность (гибель и ее время, время работы до утомления, степень изменения показателей гомеостата и др,), Отношением этого показателя в опыте к контрольному вычисляют коэффициент защиты. Для изучения токсичности отбирают препараты, 20 показавшие наибольший коэффициентзащиты среди тех, которые дали его больше единицы. Отобранные на уровне целого организма препараты вводят белым мышам или другим лабораторным животным (по 10 животных на дозу) парентерально в возрастающих концентрациях и определяют минимальную смертельную дозу. Отношением минимальной дозы, дающей максимальный коэффициент защиты, к минимальной смертельной дозе вычисляют коэффициент токсичности. Чем меньше коэффициент токсичности, тем, предпочтительнее препарат для дальнейших испытаний.Для оценки препаратов выделяют три показателя сравнительного отбора: 1-минимальную концентрацию, дающую максимальный коэффициент защиты на клеточном уровне; 2 - то же, на организменном уровне; 3 - коэффициент токсичности. Наиболее эффективные препараты подвергают дальнейшему изучению известными способами.Отбор на клеточном уровне. На сенной среде общепринятым методом выращиваем трехнедельную культуру инфузорий Рагагпес(цгп Сацда 1 цгп (методы исследований в ветеренарной микологии М., 1971). Взвешивают 30 мг высушенного вакуумированием экстракта элеутерококка и растворяют его в 3 мл профилированной через 2 слоя марли среды с инфузориями. Отсюда в три пробирки переносят по 0,3 мл жидкости и добавляют в них по 2,7 мл среды с инфузориями, Получают концентрацию препарата 1.10Две пробирки оставляют для опыта, а из одной в три следующие пробирки переносят по 0,3 мл жидкости и добавляют в них по 2,7 мл среды с инфузориями. Получают концентрацию препарата 1.10 ф. Повторяя описанную операцию, получают разведения препарата до 1.10К каждому разведению препарата ставят по одной контрольной пробирке с инфузориями. Все9901 89 Таблица 1 Время жизни инфузорий мин , контактировавших с элеутерококком в разведениях 1.10 З - 1, 10при действии йаС Датаопыта Опыт Контроль 1.10 З10-4 1. 101, 10 а 21,0 15,0 8,0 13,0 07.07.75 1 22, 0 11,0 12,0 90 22,0 21,0 15 5 11,0 12,0 90 18,0 25,0 14,0 9,0 13,0 9,0 25,0: 19,0 13,0 11,0 Ср, 12,50 8,75 23,50 14,37 19,75 10,50 0,840 1,880М кз 10 0,700 1,580 1,150 5арооирки оставляют на 24 ч при 25 С. Затем в пробирки первого разведения и кон. троля осторожно и равномерно приливают по 0,3 мл 8%-ногораствора хлористогонатрия, . Жидкость переливают в микро- аквариумы диаметром 1,0 см с прозрачным дном и под микроскопом МЯ 130 при увеличении в 100 раз с помощью секундомера определяют время жизни контрольных и опытных инфузорий по прекращению активных хаотических движений и лизису клеток. То же самое повторяют с осталь ными разведениями. Среднее время жизни контрольных инфузорий принимают за еди- ницу. Отношением среднего времени жизни инфузорий, контактировавших с каждым разведением препарата, к контрольному определяют коэффициент защиты (КЗ) . Результаты опытов с элеутерококком и расчетов коэффициентов защиты приведены в табл. 1.Из табл. 1 видно, что элеутерококк в разведений 1.10 4 почти в два раза удлиняет 26 время жизни инфузорий, подвергнутых неблагоприятному действию соли. Это говорит о проявлении его защитного эффекта.Отбор на организменном уровне.Подбирают 4 группы белых мышей по 10 животных . с весом 30 - 32 г каждая, Контрольным животным вводят подкожно по 0;1 мл. дистиллированной воды. Мышам подопытных групп вводят в том же объеме и тем же путем водные растворы предварительно высушенного вакуумированием ЗО экстракта элеутерококка в дозах 0,1, 1,0 и 10,0 мг на 1 кг веса. Через 1 ч животным к хвосту прикрепляют свинцовый грузик в 5% от веса тела и заставляют плавать в стеклянном сосуде с водой при 23 С. По секундомеру отмечают время (в с) утопления каждой мыши по группам. Момент утопления характерен определенными признаками (круговые движения в толще воды без выныривания, тело вытянуто, голова откинута назад, рот открыт, конечности 4 О оттопырены). Среднее время плавания для контрольных мышей принимают за единицу. 6Отношением среднего времени плавания опытных мышей в каждой до контрольного определяют коэффициент защиты (КЗ) Достоверность коэффициентов зашиты определяют одним из принятых методов статистической обработки данных. Результаты опытов с элеутерококком и расчетов коэффициентов защиты приведены в табл. 2.Из табл. 2 видно, что во всех испытаниях элеутерококк стимулировал выносливость животных.Отбор по токсичности,Общепринятыми методами определяют смертельную дозу элеутерококка при внутри- брюшном введении. Она равняется 0000 мг накг веса. Отношением минимальной дозы, дающей максимальный коэффициент зашиты в опытах на организменном уровне (1,0 мг) к минимальной смертельной дозе (10000 мг) определяют коэффициент токсичности элеутерококка, Он составляет 0,000.Таким образом, для элеутерококка показателями сравнительного отбора, установленными данным способом, по которым оценивается препарат, будут:- 1,10 4/1,880 2 - 1,0 мк/кг 1,578; 3 - 0,0001 Результаты эффективности элеутерококка, полученные предла гаемым способом, соответствуют данным, установленным И. И. Брехманом идругими исследователями. Использование предлагаемого изобретения позволит повысить эффективность,и результативность изыскания препаратов, повышающих защитно-приспособительные возможности организма, Становится возможным массовый отбор химических веществ. Например, для отбора 100 химических веществ на клеточном уровне необходимо затратить всего 25 человеко-дней. Опыт показал, что из 100 веществ для отбора на организменном уровне остается не более 10. Значит, вместо 5000 белых мышей, необходимых для отбора существующим. образом, будет затрачено 500 животных и соответственно в 10 раз сократятся сроки отбора.990189 Т а б л и ц а 2 Время плавания мышей, секунды, после введения элеутерококка в дозах, мг/кг дои/и Контротль 0,01 10,00 1,0 80 110 125 30 110 130 115 140 80 4 85 5 105 6 115120 120 160 150 130 165 145 165 168 200 175 200 205 135 165 220 210 220 230 250 175 285 250 190 10 315 Ср. 116 179 172 КЗ 1,000 1,483 1,578 формула изобретения Составитель А.Макаров Редактор А.Шандор Техред И, Верес Корректор М. Шароши Заказ 11030/5 Тираж 711 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 41. Способ отбора веществ-адаптогенов, 4 включающий введение испытуемого вещества лабораторному животному с последующим определением выносливости организма животного путем сравнения с контрольным животным, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности от бора, перед введением лабораторным животным испытуемых веществ проводят скрининг последних на средах с микроорганизмами с отбором обладающих наибольшим защитным действием веществ.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, 50 что в качестве среды с микроорганизмами используют среду с инфузориями при концентрации испытуемого вещества 1.101.10 на мл при культивировании в течение 12 - 24 ч при 10 - 22 С.3. Способ по п. 1, отличающийся тем,что в качестве среды с микроорганизмамииспользуют среду с дрожжами при концентрации испытуемого вещества 1.102 - 1.10на мл при культивировании в течение 24-48 чпри 28 - 30 С.Источники информации,принятые во внимание при экспеьтизе1, Патент Франции2141006,кл. б 01 М 33/00, 1974.2. Патент Великобритании135860.кл. С 12 К 1(06, 1973.3. Брехман И. И. Жень-шеньЛ., 1957,с, 30 - 33.