Способ выделения алкалоидов спорыньи из культуральных суспензий

(31)ЕРС 12 П /202798 (33) ГДР Государственный квинтет сссрОпубликовано 30,12,82,Бюллетень М 48 по лелам изобретений и открытий(53) УДК 576.8. .093.1 (088,8) Дата опублткования описания 30.12.82 Иностранцы "Вернер Граверт, Брйгитте Неуманн, Лудвиг Шиед, Калкейц Хейдеибтут Кристоф Паут, Рудолф Ширутшке и Моника Мюллер. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СУСПЕНЗИЙИзобретение относится к промышленному получению алкалоидов спорыньи, в частности для терапевтических целей, из глубинной и воздушной культур.Важной характеристикой сапрофитных культур спорыньи является то, что о разуюшиеся влкалоиды (рас творимые в воде типа эргометрина, клавины, частично также пептидные) более или менее выраженно распределяются на клеточную массу и жидкую часть культуральной суспенаии. Известные технические решения для выделения алкалоидов спорыньи учйтывакт это обстоятельство й после отделения От биомассы и кульурального Филь трата они предусматривают раздельные методы переработки обоих или одной из двух срез (патент ВНР % 150632, патент ВНР161654, дополнительный патент к. патенту ВНР150631, па- о тент ГДР41967, патент Австрии250770), согласованные со специаль д ными свойствами растворимости Образовавшихся алкалондов, Для выделения раст воримого в воде эргометрина рекоменду-. 2ется добавка значительных количеств соли (заявка ВНР Я 1-440), Предлагаемая в патенте ВНР 142407 и патенте. ВНР 142406 адсорбция на бентоните с последуюшей экстракцией адсорбата с помошью водных спиртов невыгодна из-за больших потерь вследствие изомеризации. Поэтому большое количество онытов проведено для технологически и экономически более выгодного процесса выделения путем однорядной переработки культуральной суспензии. В патент ГДР С 12 д /165 516 описывается непборедственная экстракция суспензии, однако образование эмульсии и склонность к изомерии в зависимости от ритма перв- работки снижают практическую ценность этого метода. Цель изобретении - разработка экономически выгодного способа переработки, который ликвидирует недостатки известных методов при консеквентном внедрении однорядного принципа и является универсально применимым для всех, 3 085типов алкалоидов спорыньи в сапрофитной культуре.Найдено, что способные к набуханиюглиноземы так же, как и бентонит, отбеливаюшая глина, фуллерова земля илисукновальная глина, при естественномзначении рН культуральной суспензии псы.казывают чрезвычайно высокую адсорбционную способность не только для эргометрина, но и для всех проверенныхалкалоидов спорыньи самых различныхструктур,Изготовленные таким образом смесимицелий - адсррбент механически хорошоразделяются фильтрацией или другимиспособами.Полученные после механического разделения алкалоидсодержашие смеси мицелий - адсорбент отлично консервируютсябез изомеризации или разложения алкалоидов при необычных для них температурах 80-90 фС сушкой в псевдоожиженномслое при соблюдении определенных физиоческих условий. Полученная стойкая прихранении в любых условиях сухая массамицелий - адсорбент мягко и полностьюэкстрагируется после набухания в небольшом количестве слббошелочного водного,раствора с помощью органических апротонных растворителей.В дальнейшем устанавливают, что способ сушки можно перенести на такиекультуры, которые содержт в биомассевсе образовавшиеся алкалоиды и тем самы не требуют добавления адсорбентов.После механического разделения исушки в псевдоожиженном слое получают стойкий при хранении сухой мицелий,переработку которого мозно провестинезависимо от срока сбора культуры.Сущность изобретения состоит в том,что собранные культуральные суспен-зии, содержащие любой спектр алкалоидов спорыньи, как эргокриптин, эрготамин, эргокристин, эргокорнин, эргометринлизергиновая кислота, аргоклавин, эргозин или другие., при наличии в спектрерастворимых в воде частей сначала перемешивают в течение Около 30 минс 4-5 вес,% (считая на объем урожая),глинозема, способного к набухвнию, иразделяют механически, например фильтрованием, твердые и жидкие фазы, Полученный влажный мицелий или смесьвлажный мицелий - адсорбент сушат впсевдоожиженном слое при 80 90 Св течение 20 40 мин до температурыотходящего воздуха 50-70 С и до остаточной влажности максимально 15%,020 4Сухой мицелий или смесь сухой мицелий - адсорбент при необходимости пооле растирания в пасту с водным слабешелочным раствором, например 15%-нойаммиачной водой, подвергают экстракциис апротонным органическим растворителем, например низшим эфиром алкилкарбоновой кислоты, ацетоном, или галогенированным углеводородом, полученныйэкстракт в случае необходимости дляудаления неосновных балластных веществподают на жидкОстнО жидкостную экстракцию с воднокислой фазой в объемномсоотношении от 2:1 до 1:1. Водный, содержащий все алкалоиды раствор послеподшелачивания до значения рН в пределах 8-9,5 реэкстрагируют органическимнесмешкваюшимся с водой растворителем,преимущественно этилацетатом, в соотношении От 1;1 до 3:1. Дальнейшую перепереработку предварительно очищенногоэкстракта осуществляют известным способом, принимая во внимание химическиеи физические свойства соответствующихалкалоидов,П р и м е р 1. 200 л культуральнойсуспензии штамма Сбхщсерн ригрцгеаЕг.)ТО 0. ЭМЕТ РА 130 (хранится вЦентральном институте микробиологии иэкспериментальной терапии, Йена) перемешивают и течение 30 мин с 8 кгбентонита и затем фильтруют через вращающийся ячеистый вакуум-фютьтр с10-миллиметровым слоем из дигидратасернокислого кальция. Фильтрат, практически свободшяй от алкалоидов, выбра-.сывают, снятую смесь влажный мицелийбентонит сушат в псевдоожиженчом слоепри температуре приточного воздухао90 С до тех пор, пока температура Отеходйцего воздуха не достигнет 60 Спродолжительность около 30 мин), Получают 20-24 кг смеси сухой мицелий -бентокит с остаточной влажностью 3-5%,которая содержит 95-100% эргохоксина,определенного в культуральной суспензиии 92-96% эргометрина.П р и м е р 2. 100 л культуральнойсуспензии штамма Иачсер 5 ророгеаперемешивают в течение 1 ч с 5 кготбеливвюшейгглины, фильтруют, и смесьвлажный мицелий - отбеливаюшая глинасушат в псевдоожиженном слое в течение15 мин при 80-90 С до температуры ото фходящего воздуха 50 ОС. Получают 12 кгсмеси сухой мицелий - отбеливаюшаяглина с остаточной влажностью 10-12%и содержанием алкалоида 92-100%, считая на культуральную суспензию.5 9 МП р и м е р 3. 10 кг приготовленной по примеру 1 или 2 смеси сухой мипелий - адсорбент смешивают с 1,5 лразбавленной 1;2 аммиачной воды, после 5-10 мин набухания перемешивают с З40 л этилацетата и двух поршщх по15 мин с ЧИрамггмх и от:асывают, Общий экстрат вместе с 20 л 3%-ной водной фосфорной кислоты пропускают через сепаратор. К тяжелой фазе прибав ф ляют 8 л этилацетата, при перемеиввании устанавливают рН 8,5-9,0, добавляя концентрированную аммиачную воду и 10 минперемешивают. После разделения фаз цроцесс повторяют с 6-8 л этилацетата еше 1 два раза. Обший экстракт концентрируют до 0,3-0,6 л в вакуумном циркуляционном испарителе, в выпарном аппарате с нисходящим потоком управляемой жидкости или другим мягким методом упар ки, смешивают с двойным объемом хлороформа и отделяют эргометрин в форме труднорастворимого хлороформного аддукта, Из фильтрата получают после очистки адсорбционной хроматографией колоьным или периодическим способом эрго- токсин в виде бензольного или толуольного аддукта. Оба аддукта очишенм тонкослойной щюматографией и содержат 96-103% алкалоида в расчете на бима- ЗОлеинат. Выход составляет 58,6 г эрготоксинтолуол аддукта (72%) в расчете на культуральную суспензию и 40,5 г эргометрин-хлороформ-аддукта (82%) в расчете на культуральную суспензию. ИП р и м е р 4. 60 кг полученной по примеру 1 или 2 смеси сухой мицелийадсорбент сме 1 пивают с 7,5 л разбавлен-ной 1:1 аммиачной воды, экстрагируют в экстракторе с мешалкой 150 л хлорм аф форма или хлористого метилена в течение45 мин, экстракт фильтруют под давлением и экстракцию повторяют с тем же объемом растворителя в течение 30 мин.Общий экстракт пропускают через се- и паратор с 5%-ной водной винной кислотойв соотношении 1:1, водную фазу непрерыв.но устанавливают на рН О и сепарируют .второй раз с тем же растворителем или с этилацетатом в соетношении 2:1. Поо-,й ле выпаривания, отделения эргомвтрина, и осаждения эрготоксина получают продукты с выходом и качествомуказанным в примере 3. П р и м е р 5. 30 л культуральногоЯраствора штамма СРсй 1 СЕр 5 рогрогЕа1 МБТ РА. 134, образующего эргозинперемешивают при естественном значении 020 6 срН 5-6 в течение 30 мии с 1,2 кг бен тонита, отсасывают через слой дигидрата сернокислого кальция и фильтрат выбрасывают. Сушка смеси влажный мицелий - бентонит цо примеру 1 дает 28 кг стойкой при хранении смеси сухой мицелий - бентонит, которая содержит аналитически определенные в: культуральной суспензии алкалоиды (эргозин, эргозинин, следы каиоклавина) практически 160%.Экстракционный эффект при экстракции с перемешиванием с 10-12-кратным количеством этилацетата составляет в среднем 90% в расчете на содержание смеси сухой мицелий бентонит.П р и м е р 6. 20 л культуральной суспензии штамма, приведенного в примвре 5, фильтруют без добавления адсррбента через 20 миллилитровый слой дигидрата сернокислого калымы, филь- трат, содержащий только следы эргоэииа и часть сопутствующих алкалоидов, выбрасывают. Выделенный влажный мвцелий сразу сушат в псевдоожиженном слое при 90 ОС до температуры отхадящего воздуха 60 С (продолжительностьооколо 40 мин). Получают 0,8-1,0 кг стойкого при хранении сухого мицелия, котррый содержит 96-100% определенного в культуральной суспенэии эргоэииа,а также следы сопутствующвс алкалоидов,.Для получения алхалоида сухой мицелий после смешивания с 150 мл 10%-ной аммиачной воды экстрагируют при перемешивающ с 8 л хлороформа в двух порциях и после перевода в водно кислую фазу, реэкстракции и выпаривания иэ полученного концентрата союза дают винной кислотой в виде тартратасырца. Формула изобретения 1, Способ выделения алкалондов спорыньи из культуральных суспензий, о ъл и ч а ю ш и й с я тем, что собранную культуральную суспензию в естественном состоянии после перемешивания с глиноземом, способным к набуханию, механически разделяют, например фильтрацией, смесь влажный мицелий - адсорбент сушат в пеевдоожиженном слое, смешивают дда набухании с аммиачной водой, эка трагируют органическими апротонными растворителями и экстракт перерабатыФ вают известным образом.7 ,985020 82. Способ по п,1, о т л. и ч а ю - ных растворителей для экстракции тверщ и й с я тем, что в качестве глинозе- дое вещество - жидкость применярг низма, способного к набуханию, применяют шие эфиры алкилкарбоновой кислоты, 4 5 вес.% бентонита и перед механичео- преимущественно этилацетат, ацетон, ким разделением культуральную суспен- з или галогенированные углеводороды, презию перемешивают с адсорбентом в тече- имущественно хлороформ или хлористый ние 30 мин, метнлен, и смесь сухой мицелий - ад 3, Способ по п.1, о т л и ч а ю - сорбент перед экстракцией смешивают ш и й с я тем, что сушку смеси влажный для набухания с 10-20 вес.% аммиачмицелий адсорбент осуществляют в 10 ной воды и экстракт-сырец перерабатыпсевдоожижеином слое при 80-90 С в вают известным способом.течение 20-40 мин до температуры отходящего воздуха 50 70 С и остаточной . Признано изобретением по результевлаги ие более 18%, там Экспертизы, осуществленной ведом 4 Способ по п.1, о т л и ч а ю - 1 з ством по изобретательству Германской ш и й с я тем, что в качестве апротон- ДемократическЬй Республики.Составитель Б. Йрных Редактор Н. Кешеля. Техред Л,Пекарь Корректор Г. Решетник Заказ 10082/31 Тираж 508 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо дедам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4