Способ получения макроглобулина

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик р 1) 961695(23) Приоритет 1511 М К з А 61 К 35/16 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 300982, Бюллетень МВ 36 531 УДК 612.398. .132(088,8) Дата опубликования описания 30.09,82 1)гГС1 ЛЯ 1 т Я1 Ц тЯ 1)ТЦ 0- БИБЛ;10 П.:.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .МАКРОГЛОБУЛИНА Изобретение относится к медицинь и может быть использовано для получения препарата макроглобулина, используемого в диагностических целях и иммуннохимических тестах.Известен способ получения макро- глобулина путем изобретательного высаливания сыворотки крови, диализа концентрата, гель-фильтрации диализата с последующей ионообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продуктаЦ .Однако макроглобулин, полученный . известным способом, не облат.ает способностью подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммуннотоксических реакциях.Цель изобретения - придание макроглобулину свойств подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммунохимических реакциях.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получейия макро- глобулина путем избирательного высаливания сыворотки крови, диализа концентрата, гель-Фильтрации диализатас последующей ионообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта, сыворотку кровибольных острым вирусным гепатитомизбирательно высаливают сульфатомаммония .с концентрацией 40-44,гель-фильтрации подвергают диализируемый экстракт на геле типа сефадекс 6-200, выделяют фракцию с параметрами элюции Ко,1-0,2, полученную Фракцию концентрируют и диализуют против 0,005-0,01 М фосфатного буфера при рН 6,5-6,8, да лее диализат центрифугируют, полученный супернатант подвергают ионообменной и аффинной хроматографии иэлюат стабилизируют аминометилольным прс изводным формальдегида и 20 Е-лейцина.П р и м е р . Способ пблученияпеченочного макроглобулина.В качестве источника для полученияпеченочного макроглобулина (ПМ) пред почтительно использовать сывороткубольного острым вирусным гепатитомв период наибольшей активности воспалительного процесса в печени.К смеси сывороток при активном 30 перемешивании вносится насыщенныйраствор сульфата аммония до концентрации 44. Осадок формируется в те"чение 16-18 ч при 4 С. Выпавший белок отделяется центрифугнроваинемпри 6-8 тыс об/мин в течение 30 мий.Полученный осадок растворяется намагнитной мешалке в дистиллированнойводе в объеме, составляющем 1/10часть от.исходного. Если растворениеосадка не производится, то он устойчив к хранению при 4 С с сохранениемактивности ПМ в течение 2-3 месяцев(срок наблюдения),Подготовленный раствор белка диализируется против 0,15 М;растворахлористого натрия рН=7,2 в течение24-48 ч при 4 С. Диализованный экстракт подвергается гель-фильтрациичерез сефадекс Снли ультрагельАсА 34. Используется колонка размером 3,0 100,0 см, предварительнозаполненная гелем и эквилибрированная0,15 М раствором хлористого натриярН=7,2. Гель-фильтрация направлена на получение первого макроглобулярного пика, выходящего в свободном объеме геля, Фракции объединяюти концентрируют активным диализомили инфильтрацией,По окончании предыдущего этапапрепарат наносится на колонку, заполненную сефарозой 6 В или ультрагелем АсА 22 и эквилибрированную0,15 М раствором хлористого натриярН=7,2; Эта хроматография направлена на получение активных .фракций, содержащих печеночный макроглобулин, т.е,способных тормозитьмиграцию лейкоцитов в гемокультуре.При использовании сефарозы 6 В илиультрагеля. АсА 22 печеночный макроглобулин выявляется во фракцияхнепосредственно следующих за первымбелковым пиком в свободном объемегеля. Активные фракции объединяются,концентрируются и диализуются против 0,005 М Фосфатного буферарН=6,5 в течение 24 ч при 4 С. Выпавшие хлопья белка в процессе диализа удаляются центрифугнрованиемпри 6-8 тыс.об/мин в течение30 мин,На подготовленный ДЭАЕ сефадексА, уравновешенный 0,005 М фосфатным буфером рН=9,5, наносится диализованный препарат почечного макроглобулина. Не прореагировавший сионообменником белок элюируется0,005 М фосфатным буфером рН=6,5Скорость протекания элюирующего раствора через колонку 10-20 мл в час,Соотношение анионит.: белок 5:1.Элюирование веществ с ионообменника проводится линейным градиентом5хлористого натрия от 0,01 до 1,0 Мв фосфатном буфере рН=6,5Активныефракции, элюированные 0,2-0,4 М хлористого натрия, объединяются, концентрируются и диалиэуются против 0,1 М10 трис-НС 6 буфера, рН= 7,2,На подготовленную колонку, заполненную сефарозой СВ -4 В и коньюгированную специфическими антителами кпеченочному макроглобину, наносится"5 диализованный препарат ПМ. Скоростьпротекания 1-2 мл в час. По окончании движення всего раствора черезколонку она промывается 0,1 М трисНС 1 буфером, рН=7,2 до нулевых пока 20 эаний поглощения света при Ео .Элюирование печеночного макроглобулина с колонки осуществляется0,2 М глицин-НСР буфером, рН=2,2.По мере получения раствора белка25 величина рН раствора доводится до7,2. Выделенный белок концентрируют и диализуют против 0,15 М раствора хлористого натрия.Учитывая, .что выделение печеноч 30 ного макроглобулина производится изпотенциально инфицированного сырьясыворотки крови человека, больногоострым вирусным гепатитом, конечный препарат обрабатывается фор 35 мальдегидом в присутствии Е-лейцина.Этот прием позволяет сохранитьантигенную активность ПМ,снизитьинфекционйостьи достичь стабильности препарата.К раствору белка печеночногомакроглобулина в соотношении 1:1добавляется 0,132 М Е-лейцина и0,0066 М формальдегида, Полученнаясмесь выдерживается при 32-374 С в45 течение 72 ч, после чего препаратможет храниться при 4 С в течениеодного года (срок наблюдения) безизменения антигенной активности исохранением стерильности раствора.50 В случае радиоактивной метки ПМиспользуется Формальдегид, радиоактив.ный по С , Для удаления не прореагировавшего аминометилольного соединения препарат подвергается гель.5 фильтрации через сельфадекс 6-50.В таблице приведены характеристики печеночного макроглобулина.961695 Характер реакции Свойства Физико-химические:молекулярная массаизоэлектрическая точкаэлектрофоретическая подвижность в агаре и агарозе Иммунохимические:окрашивание линий преципитации на белокна гликопротеидына липопротеидыреакция иммунологической неиден- тичности реакция иммунологической неидентичности с, нормальными белкамикрови человека Биологические: локализация и место образованияобнаружение в экстрактах тканей плодов и взрослыхвыведение из организма Печень, гепатоцит влияние на миграцию лейкоцитоввлияние на прижизненную проницаемостьмембраны лимфоцитов человекадля хлортетрациклина Тормозит миграциюНарушает проницаемость. влияние на процессы дыхания печеночных митохондрий крысы Ингибирует дыхание наибольшая частота встречаемостидлительность выявления у больных острым вирусным гепатитом (А и В)обнаружение среди здорового населения и серологических реакциях для диаг ностики поражений печениСпособполучения макроглобулина путем избирательного высаливания сыИ воротки крови, диализа концентрата,.Клиническая характеристика: Предлагаемым способом выделяют белковую фракцию более 200000 дальтонПолученная белковая фракция обладает способностью тормоз)ть миграцию лейкоцитов в гемокультурах. При иммунизации животных этим фактором удается получить антисыворотку, которую используют В иммунологических 600.000 т 200.000 дальтонрН = 4,5+0,3Аналогично а -глобулину ОкрашиваниеОкрашиваниеОкрашивания нета протеина НВ 5 антигенртканевой в -глобулин,трофобластический фак-тор Преальбумин, альбумин,фибриноген, тромбнн,перулоплазмин, трансферин, а-в липопротеины,а-в гликопротеины, а-вмакроглобулины, иммуноглобулины А, И, С, О, Е Не обнаруженОбнаружен в макрофагахдермального слоя кожи Больные с гепатотропными заболеваниямиОт 2 до 20 дня от начала клинических проявлений заболеванияНе обнаружен формула изобретения961695 Составитель М.КовалевскаяТехред А. Бабинец Корректор Ю.Макаренко Редактор И.Тыкей Заказ 7350/7 Тираж 714 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 гель-фильтРации диализата с последующей ионоообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевогопродукта, о т л и ч а ю щ и й,с ятем, что, с целью придания макроглобулину свойств подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизацииживотных и реагировать с антителамив иммунохимических реакциях, сыворотку крови больных острым вирусным гепатитом избирательно высаливают 4044 - ным сульфатом аммония, гельфильтрации подвергают диализируемый экстракт на геле типа сефадекс 0-200 выделяют фракцию с параметрами элюции Кп, 1-0,2, полученную фракцию концентрируют и диализуют против 0,005-0,01 М фосфатного буфера при рН 6,5-6,8, далее диализат центрифсгируют, полученный супернатант подвергают ионообменной и аффинной хроматографии и элюат стабилизуют аминометилольным производным формальдегида и Е-лейцина.Источники информации, принятые во внимание дри экспертизе 1. Фримель Х. Иммоннологическиеметоды. М., Мир, 1979.