Способ определения фазового сос-тояния внутриклеточной воды

Оп ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сфиаэ СоветсиинСфцмалистичесиинреспубликц 830212(51)М. Кл. 601 й 24/10 твеудерственнмй квинтет СССР ао делам наебретеннй н открытий(53) УДК 538. . 1 1.3(088.8) Н, С, Пушкарь. В, А. Моисеев, Л, В,В, К. Кальтовер и И, И, Гаврилова";ру,-Р;Институт проблем криобиологии и кр медатййты" -.":ц "АН Украинской ССР Бй ц-:т; -,(72) Авторы изобретения(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗОВОГО СОСТОЯНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ВОДЫ3Изобретение относится к криобиологии и может найти применение при исследо- . "вании процессов низкотемпературного кон-. сервирования различных биологических объектов.Одним из основных повреждающих фак 5 торов клеток в процессе низкотемпературного консервирования считается внутри- клеточная кристаллизация. Поэтому определение фазового состояния внутриклеточной воды является важным этапом исследования процессов низкотемпературного консервирования.Известен способ определения фазового состояния воды с помощью сетевой микроскопии, основанный на изменении опти-. ческой плотности жидкой фазы при ее кристаллизации или изменении вращения плоскости поляризации света Ь 3.Основным недостатком этого способа является то, что при исследовании клеток малых размеров ( д ,10 30 мк) происходит маскировка внутриклеточного содержимого внеклеточным льдом. 2Наиболее близким к предлагаемомуизобретению является способ определения фазового состояния внутриклеточнойводы методом электронно-микроскопическойкриофрактографии. Согласно этому биоло- .гический образец быстро охлаждают в пе,реохлажденном пентане и раскалывают вглубоком вакууме. Затем проводят напыление платины и углерода на поверхностьраскола, т.е. получают. реплику поверхности раскола в просвечивающем электронном микроскопе 2.Однако при изготовлении среза образца возмсвно иннцнрование внутриклеточной кристаллизации за счет непосредственного контакта охлажденного ножамикротома с переохлажденным внутриклеточным содержимым. Из-за малой разрешающей способности трудно идентифицировать реплики граней кристаллов льда,особенно малых размеров,Бель изобретения - повышение точности определения фазового состояния внутриклеточной воды.02124 50Источники информвшж,принятые во внимание при экспертизе1. рЕгег К.р.,с гачае 0 Г,., Н 1 00 с,ЗнгасеВРоОаг РгЕе 1 щ ю 81 оваег 1 аЕ 0;ф 6 гэоЫоЕщу .4972,Ч. Ч р. ФВО,552. ВоРбчсю 1 8. Геезе -е 1 сЬп 1 есйп 1- оцее аррйед 10 04 оео 1 саа ееюбгапее,РЬЙ. ТГОИЬ, РОМ, Ьос. 1 чо 1 дои, (9 74, Ч, Ь.2,68 891 р, У- Й (прототип). 3 83Указанная цель достигается тем, чтов способе определения фазового состояния внутриклеточной воды, основан. ного на охлаждении биологическогообразца и последующего анализа состояния воды внутри клетки, исследуемую взвесь клеток вводят в воднйй раст- вор, содержащий иминоксильный радикалконцентрацией" 1 СГ -2 10 М и парамагнитную соль концентрацией 1- 2 М,после чего по мере охлаждения регистрируют спектр ЭПР иминоксильногб радикала, проникшего внутрь клетки, по .виду которого судят о фазовом состояниивнутриклеточной воды.На фиг. 1-5 изображены спектрыЭПР, наблюдаемые в процессе осуществления способа.Способ осуществляют следующим образом.В стеклянную ампулу, вводят 0,11,0 мл водного раствора иминоксильуогорадикала концентрацией 10210 Ми на радиоспектрометре наблюдают сигналЭПР (фиг. 1). Затем в ампулу добавляют0,1-1,0 мл водного раствора парвмагнитной соли, концентрацией 1-2 М. В результате обменного взаимодействия сигналЭПР от минимального радикада полностьюуширяется и исчезает (фиг.2) Затем вампулу вводят 0,8-8,0 мл взвеси биологического объекта, разведенной физиологическюл раствором ( 1:5), и наблюдаютсигнал ЭПР от радикалов, проникающихвнутрь клетки (фиг.З), Парвмагнитныеионы в норме через биологическую мембрану не проникают, что позволяет следить за сигналом ЭПР радикалов в цитопдазме клетки. Затем раствор охлаждают со скоростью 3 5 мин и наблюдаютспектр ЭПР.Цид и форма линии спектра ЭПР иминоксильного радикала зависит от характераи скорости вращательной диффузии радикала в растворителе, которая резко меняется при переходе из жидкой фазы втвердую в случае замерзания раствора.Причем спектры ЭПР радикала внутриклетки различны, в зависимости от того,кристаллическое или стеклоофвзное состояние твердой фазы внутри клетки, Впервом случае кристаллы льда вытесНяютрадикалы друг к другу и сигнал ЭПРпредставляет широкую линию (синглет)(фиг.4). В случае стеклообрвэного"состояния при замораживании радикалы равномерно распределены в объеме внутри клетки и спектр ЭПР имеет вид, показанный, на фиг. 5. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 П р и м е р. В стеклвнную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора юлиноксильного радикала концейтрацией 10 Ъ/ л и на радиоспектрометре наблюдают сигнал ЭПР (фиг. 1). Затем в ампулу добавляют 0,1 мл водного раствора пврвмагнитной соли ЙС 1 концентрацией 1 М, После исчезновения сигнала ЭПР от иминоксильного радикала (фиг.2) в ампулу добавляют 0,8 мл взвеси фибробластов, разведенной физиологическим раствором (1;5) и наблюдают сигнал ЭПР от радикалов, проникших внутрь клетки (фиг.3), Затем взвесь фиброблвстов с введенными внутрь цитоплвзмы радикалами охлажодают со скоростью 3 С/мин и наблюдают спектры ЭПР радикалов внутри клеткио о через каждые 2 С, При - 45 С (тем-. пература кристаллизации) во взвеси фиб-, роблвстов появляется сигнал ЭПР, ха,рактеризующий кристаллическое состояние воды внутри клетки (фиг.4)Таким образом, данный способ позволяет однозначно определить стеклообразное и кристаллическое состояние воды внутри клетки в процессе низкотемпературного консервирования, не повреждая при этом ее структуры, что дает дополнительную информацию при разработке новых способов ниэкотемпервтурного консервирования биологических объектов. формула и э о б р е т е н и яСпособ определения фазового состоянтя внутриклеточной воды, основанный на охлаждении биологического образца и последующего анализа состояния Ьоды внутри клетки, о т л и ч а ю щ и й- . с я тем, что, с целью повышения точности определения, исследуемую взвесь клеток вводят в водный раствор, содержащий иминоксильный радикал концент-Я. -2рацией 10 -2 10 М и парвмагнитную соль концентрацией 1-2 М, после чего по мере охлаждения регистрируют спектр ЭПР иминоксильного радикала, проникшего внутрь клетки, по виду которого судят о фазовом состоянии внутриклеточной воды./26 Тираж 907 Подпи ВНИИПИ Государственное комитета ССС цо делам изобретений и открытий Москва, Ж-З 5, Рауааткая наб., д. 4/б к 113035,или актор Т, Весаз 2791оставитель В. Покатиловва Техред Н.Келущак К П Патент, г. Ужгород, ул. Проектн