Способ оценки стресс-устойчивости животных

(п)782781 Союз Советскик Социалистинеских Республик(23) Приоритет -Государственный комитет СССР по делам нзобретеннй н открытий(088,8) Дата опубликования описания 301180(72) Авторы изобретения В.И.Шепотиновский и З.И.Иикашннович Ростовский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СТРЕСС-УСТОЙЧИВОСТИЖИВОТНЫХ Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медици-ны, конкретно к методам отбора животных для эксперимента, и может быть использовано для выявления устойчи" вых животных к действию шокогенной травмы.Известен способ оценки стресс- устойчивости животных по реакции напряжения задней части тела в ответ на галатановый наркоз.Однако данный способ не позволяет выявлять животных, устойчивых к действию шокогенной травмы.1Наиболее близким к изобретению по 15 технической сущности является способ определения функциональных воэможностей организма по уровню ферментной активности сыворотки крови животных, заключающийся в том, что определяют 26 активность в крови креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфотазы, аспартатаминотрасфенаэы и О -глутамнлтрансферазыи по изменению уровня активности ферментов по срав нению с нормой оценивают функциональ" ные возможности организма.Однако данный способ также не обеспечивает отбора животных, устойчивых к шокогенной травме, 30 Целью изобретения является разработка способа выявления животных, устойчивых к действию шокогенной травмы.Цель достигается способом, заключающимся в том, что у животного при его иммобилизации исследуют в лейкоцитах и эритроцитах периферической крови комплекс субстратов и ферментов обмена глюкозы и глюкозо-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы и показателей окислительно-восстановитель- ных процессовг содержание лактата, акг тивности цитохромокскдазы, и по увеличению показателей активности указанных ферментов и содержания субстрата в лейкоцитах соответственно на 50-551, 60-65 и 60-70, 70-100, в эритроцитах соответственно на 70-80, 60-100 и 40-50, 180-300 по сравнению с исходным уровнем судят об устоЯ- чивости животных к шокогенной травме.Способ осуществляют следующим образом.Отобранное для опыта животное, например собака (беспородная), осматривается ветеринаром с целью выбраковывания животных с наличием патологии: устанавливается вбзраст, пол";- = вес. У собаки иэ бедренной вены эаби,7 55,4 108 2 100 00 б Гексокказа 00 12,7 58,7 104,5 00 4 8рается кровь в обычных спокойных усло-,виях - контроль. После этого собакаФиксируется на столе с помощью намордника, прикрепленного к столу, илямок, надетых на лапы в положениина спине - иммобилизационной стресс.С момента полной фиксации начинаетсяотсчет времени. В первые 5 мин иммобилизационного стресса у животногопутем пункции через кожу из заднейвены голени забирается 10 мл-крбви вцентрйфужные пробирки с 0,2 мл гепа- фрина (5000 ме/мл). Для предотвращения образования сгустков крови содержимое пробирки осторожно перемешивается. Кровь центрифугируется при1000 об/мин в течение 30 мин для получения плазмы. Плазма отсасйвается.Для получения осадка лейкоцитов плазма центрифугируется при 1000 об/мин,в течение 12 мин и очищается физиоло - гическии раствором от примесей эритроцитов, Полученная плотная масса клеток гомогенизируется с 3,5 мл дистиллированной воды. В 0,1 мл гомогенатаопределяется содержание белка.Эритроциты промываются несколькораз равными объемами физиологического " раствора и плотно центрифугируютсяпри 3000 об/мин, 1-2 мм верхнего слояотбрасывается. Приготавливается гемолизат с дистиллированной водой в соот-,ношении 1:20. В 0,02 мл гемолизата 30определяется гемоглобин. Расчет опре-деляемых субстратов и Ферментов, ведется на 1 г белка лейкоцитов и на 1 ггемоглобина. В приготовленные пробирки с субстратными смесями для опреде-; 35ленин Ферментов разносится по 0,2 мллизата лейкоцитов или гемолизата.Для определения лактата отбираетсясоответственно 0,2 мл биологическогоматериала и фиксируется 0,5 мл20-ной сернокислой медью, Лактатопределяется в реакции с параоксидифенилом (1,5 раствором) по методу,описанному М,И.Прохоровой и З.Н.Тупи-ковой, Большой практикум по углеводному и лицидному обмену, Л., 1965, 45Для определения активности глюкозо-фосфатдегидрагеназы отбирают0,2 мл биологического материала ипомещают в инкубационную смесь, со держащую 0,2 мл НАДФ (1,5 Мг/1 мл), 500,2 мл сернокислого магния (120 мг в 1 мл) и 0,4 мл глюкозо-фосфата(22 мг/1 мл) и ТРИС-буфер рН,5.Инкубация 20 мин при 37 С. Ферментативная реакция прекращается добавлением 1 мл .1 2 М раствора щелочи.Для определения активности гексокиназы биологический материал 0,2 млпомещают в инкубационную смесь, содержащую 0,2 мл НАДФ (1,5 мг/мл),0,2 мл сернокислого магния(120 мг/мл),0,2 мл глюкозы (2,4 мг/мл) и 0,4 млАТФ (3,1 мг/мл), 1 мл ТРИС-буферарН,5. Инкубация 10 мин при 37 С.Ферментативную реакцию прекращаютдобавлением 1 мл 1,2 М раствора щелочи. Эатем все пробы спектрофотометрируют на СФпри 340 нм. Результатывыражают вмйкромолях НАДФ (мйн) 1 г,Оценка способности клетки акцептировать кислород ведется путем определения актйвности цитохромоксидазы:для этого 0,2 мл, биологического материала помещают в среду, содержащую0,5 мп обратного буфера, рН 9,0,0,2 мп цитохрома С (0,4 мг/мл) и,окрашивают 0,4 мл диметилпарафенилендиамингидрохлорида (4 мг/мл), инкубация 10 мин при 37 оС. Результаты выражают (В.С.Асатиани, 1969) в условныхоптических единицах на 1 г (экстинция, полученная на СФ).установлено, что у устойчивых кшоку собак уровень активности ферментов утилизации глюкозы (глюкозо-фосфатдегидрогеназы и гексокинаэы),и показателей окислительно-восстановительных процессов (уровень лактатаи активность цитохромоксидазы) после5-минутного иммобилизационного стресса в лейкоцитах соответственно вышена 50-55, 60-65 и 60-70, 70-100,в эритроцитах - на 70-80, 60-100 и40-50,ф 180-300 по сравнению с данными контроля.П р и м е р 1. Собака Чернушка,вес 16 кг. Проведен осмотр ветеринаром, Признаков явной паталогии ненаблюдалось. Кровь забирадась до ипосле 5-минутного иммобилизационногостресса и в лейкоцитах и эритроцитахопределялась активность глюкозо-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы,цитохромоксидазы и уровейь лактата.Результаты определения сведены втабл,1,Т а б л и ц а 1,20 100 1,84 1 60 31 6,40 10 ьного давле70-80 ммз шокового ышение уровня исследуемых поей в клетках .крови после ного иммобилизационногосвидетельствует о том, что емое животное является устойдействию шокогенной травМы. тельно, при нанесении стантравмю цо Кеннону (200 уда" внутренней поверхности верхти бедра) у собаки Чернушки одъема артериального давле-240 ма рт.ст. регистриро кратковременная гипотония мм рт.ст.), после чего урове магистрально 1 ф ния стабилнэ рт,ст.). Со состояния,Пример 16,5 кг. Провед 2 О Признаков явной ется. Кровь заб. 5-минутного имм са и в лейкоцит делялась активн 25 моксидазы и уро таты определениго артери ировался бака вышла а б.л оэо- осфат- дегидроге- наза Глюк -б-ф 6 57,6 16 3 0 68,7 10 Гексо- киназа 7 100 56,0 100 4,9 17,18 51 с 37 100 2 с 83 Лакта охросидаэа 3,97 100 5 7 100 1,7 8 69 азателейв. зрит активности глюк геназы,гексокин и уровня лакта имаобилизацион водить отбор ус вию шокогенной Понижение уровня исследуемых показателей в клетках крови, забранной "у 5 р собаки Рыжик после 5-минутного иммобилизационного стресса, свидетель ствует о том, что исследуемое живот- ное является неустойчивым к действию шокогенной травмы. Действительно, при нанесении стандартной травмы по Кеннону (200 ударов по внутренней поверхности верхней трети бедра у собаки Рыжик послекратковременного подъема артериального давления (220 мм рт,ст развился тяжелый травматический шок 40 с выраженной шоковой гипотонией(до 40-50 мм рт.ст.), Собака погибла череэ 90 мин после нанесения травмыТаким образом, предлагаемый способ позволяет, оснбвываясь на уровне био оцита еских покоцитах,атдегидромоксидазыминутйогса, проий к дейс имичлей эо- зы,циа пос- огоойчивыхравмы. торроле 5стреособ Выявление исходного уровня"резистентности организма к шокогенным воздействиям с помошью предлагаемого способа имеет важное значение с целью выработки рекомендаций для практического здравоохранения. Учет индивидуальных особенностей пострадавшего необходим для оценки реакции на травму и разработки методов противошоковой терапии,Повказател5-минустрессисследучивымДействдартноров поней трпосления довалась(50/55 2. Собака" Рыжик, вес. н осмотр ветеринаром; патологии не наблюдаралась до и после билизационного стрес-. х и эритроцитах опресть глюкозо-фосфатексокииазы, цитохро-ень лактата. Реэульсведены в табл.2.782781 формула изобретения Составитель В,РомановаРедактор Т. Пилипенко Техред А.щепанская Корректор М.Коста Заказ 8407/3 Тираж 723 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5филиал ППП фПатентф, г.ужгород, ул.Проектная,4 Способ оценки стресс-устойчивости животныхпутем.определения биохими" ческих показателей крови до и после иммобилиэационного стресса, о т л и ч а ю ц и й с я тем, что, с целью выявления животных, устойчивых к шокогенной травме, в лейкоцитах и эритроцитах крови определяют активность глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, цитохромоксидаэы и уровень лактата и по увеличению этих показателей после иммобилизационного стресса в лейкоцитах соответственно на э 50-55, 60-5, 60-70,70-100 вэритроцитах - на 70-80,60-100,40-50, 180-300 по сравнению с исходным уровнем, животных считаютстресс-устойчивыми.