Способ культивирования -форм

(22) Заявлено 090377 (21) 2460904/28-13с присоединением заявки Мо(51)М. Кл,2 С 12 К 3/00 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Автор изобретения Л.М, Устименко Казанский государственный институт усовершенствованияврачей(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ-ФОРМ ЭЙЕРОМЕ МА РАШООМ 30 Изобретение относится к областимикробиологии,Известен способ культивированияЬ-форм Эгоропета раМЮогп путем 5пассирования культур Ь-форм на питательных средах в присутствии постепенно возрастающих концентраций пенициллина и инкубированиемпосевов (1) . 10Однако при известном способе удается поддерживать культуры в Ь-форме лишь в нескольких пассажах (3-10),а потом Ь-формы перестают расти,о 15Целью изобретения является длительное поддержание культуры в Ь- форме.1 Эта цель достигается тем, что 20 проводят пассаж на жидкую питательную среду, послеинкубирования пересевают на полужидкую питательную среду, посев инкубируют до появления вторичного роста культуры, затем 25 пересевают на жидкую питательную среду, причем пенициллин вводят в питательную среду в каждом тассаже при появлении первых признаков роста,Кроме того, концентрацию пеницилдина от пассажа к пассажу повышаютдо 4000 ЕД/мл,Способ осуществляют следующим образом,Ь-Формы бледной трепонемы любогоштамма, индуцированные или постиндуцированные, засевают по 0,3 млна среду Китта-Тароцци или на сремуКитта-Тароцци с нормальной лошадинойсывороткой, МдЯОд и сахарозой,"После посева среду заливают слоемстерильного расплавленного вазелина,Посевы инкубируют в термостате при36-38 оС (оптимальная 37 Ц); ежеднев"но просматривают, При появлеиии первых признаков видимого роста, чтовыражается легким помутнением средыи наличием активных размножающихсятрепонем при микроскопии препаратов фраздавленная капляфпод фазовоконтрастным или темнопольным микроскопом, в средудобавляют водный раствор пенициллина так, чтобы концентрация антибиотика в среде (ЕД/мл) была такой же, как и Ь-индуцирующая, прикоторой были получены Ь-формы у данной культуры, Посевы после этогоснова выдерживают 4-7 дней в термостате, Через укаэанный срок культуру со среды Китта-Тароцци пересевают в столбик полужидкого агара наоснове триптического перевара бычьего сердца или пептона Мартена с нормальной лошадиной сывороткой, нор;мальной сывороткой морской свинки,с МдЯО и сахароэой, Все тщательноперемешивают, Посев инкубируют втермостате при 36-38 С (оптимальная37 ОС) и ежедневно просматривают,При появлении первых признаковвидимого роста, что выражается легким помутнением среды или появлением отдельных колоний в нижних двухтретях столбика среды и наличием актинных размножающихся трепонем примикроскопии препаратов, в средувносят раствор пенициллина так,чтобы концентрация его в среде быпа в1,52 раза больше предыдущей в среде Китта-Тароцци, Посев снова инкубируют при 36-38 С (оптимальная37 ОС), Добавление пенициллина вызывает процесс Ь-трансформации, В течение 15-20 дней бледная трепонемаполностью превращается в Ь-формы,Инкубацию посевов в термостате продолжают до ренерсии Ь-форм, что выражается появлением на 26-60-й деньпосле посева второй волны роста вторичного роста. Это сопровождаетсяувеличением и нарастанием интенсивности зон помутнения в столбике среды, а .по периферии Ь-колоний появляются нежные облачконидные ореолы,В препаратах, приготовленных иэ этихзон роста, под Фаэовоконтрастныммикроскопом обнаруживается ренерсияЬ-форм и поянление спиралевидныхтрепонем, Культуру вторичного ростапересевают сразу же или н пределаходного месяца на среду Китта-Тароцииили на среду Китта-Тароцци со всемиукаэанными выше компонентами и далее культивирование Ь-Форм осущестн"ляют в тай же последонательности,какописано, в зависимости от поставленной задачи по длительности культивирования Ь-форм,Концентрации пенициллина н процессе культивирования поньдцают до тех пор, пока культура дает после воздействия антибиотиком на полужидкой среде вторичный рост, Если достигают предельной концентрации пенициллина, при которой вторичный рост не появляется, то посев со среды Китта-Тароцци повторяют и культиниронание продолжают беэ дальнейшего повышения концентраций пенициллина, Предельные Ь-индуцирующие концентрации пенициллина зависят от индивидуальных особенностей штамма, культуры, состояния популяции, условий выращивания, Способ воспроизводим30 35 45 50 55 60 при концентрации пенициллина 5004000 ЕД/мл,После добавления пенициллина вжидкую среду и инкубации в термостате культуру до пересева в полужидкую среду можно хранить при комнатной температуре до года,Предлагаемый способ может бытьмодифицирован следующим образом,При появлении вторичного ростана полужидкой среде эту же культуруможно снова превратить в Ь-формыповторным добавлением пенициллинав том же количестве, что и для индукции Ь-Форм до вторичного роста, спродолжением инкубации посевов втермостате. Реверсия Ь-форм прекращается после добавления пенициллина,трепонемы снова превращаются в Ь-Формы, а через определенное времяЬ-Формы снова ренерсируют и появляется третья нолна роста, Культурав этом состоянии также может бытьпересеяна на среду Китта-Тароцци, идалее культивируют, как описано.Способ может быть также использован и для первичного получения Ь-форм из исходной культуры,П р и м е р 1, Ь-формы бледной трепонемы штамма Ставрополь- ч 1 ц, полученные на 0,3-ном агаре,на основе триптического перевара бычьего сердца под воздействием 500 ЕД/мл пенициллина, засевают по 0,3 мл на среду Китта-Тароцци с 20 нормальной лошадиной сыворотки, 0,05 Мф 04, 10 сахарозы (объем среды 9 мл), Посевы заливают расплавленным вазелином (слоем 1,5-2 см), Инкубацию осуществляют в термостате при 37 ОС, посевы ежедневно просматривают, Йа 3-й день после посева в пробирке обнаружено легкое помутнение среды, Под Фазовоконтрастным микроскопом при микроскопии препара" та раздавленная капля (увеличение 40 х 10) обнаруживают хорошо подвижные, поперечно делящиеся трепонЕ- мы по 50-60 н поле зрения, Готовят раствор пенициллина на дистиллированной воде концентрации 5000 ЕД/мл, который вносят в среду по 1 мл, т.е. создают н питательной среде концентрацию пенициллина 500 ЕД/мп, Посевы продолжают инкубировать н термостаоте при 37 С н течение недели, После внесения пенициллина через два дня в теле трепонем появляются эернагранулы, в последующие пять дней образуются цисты и шаровидные формы, отмечают незначительный зернистый распад, в то же время сохраняются отдельные спиралевидные формы, На седьмой день после внесения пенициллина делают пересев по 0,3 мл культу- ральной жидкости на 0,3-ный агар на основе триптического перевара бычьего сердца с 20 нормальной лошадиной(объем среды 9 мл)Посевы инкубируют в термостате при 37 С и ежедневнопросматривают, На седьмой день встолбике среды появляется облачковидный рост и рост отдельных колоний.При микроскопии препаратов фраздавленная капля 1, приготовленных изэон роста или из отдельных колоний,обнаруживают трепонемы и реверсирующие Ь-элементы. Внесением в средув этот же день 1 мл водного растворапенициллина концентрации 10000 ЕД/млсоздают концентрацию его в среде1000 ЕД/мл.В течение 15-20 дней примикроскопии посевов наблюдают превращение трепонем в Ь-формы с образованием Ь-микроколоний с последующимростом Ь-колоний, Культура бледнойтрепонемы полностью превратилась вЬ-формы, а на 30-й день после посева (23-й день после внесения пенициллина) в столбике среды отмечаютувеличение интенсивности помутненияи эон роста за счет появления нежного облачковидного роста по периферии зон роста и 1 -колоний, т,е, регистрируют вторичный рост, Микроскопией культуры выявлена реверсияЬ-форм с превращением их в трепонеьы, Культуру на следующий день снова пересевают на среду Китта-Тароцци с указанными компонентами, Послепересева в эту же культуру вторичного роста снова вносят пенициллиниэ расчета 1000 ЕД/мл среды, Культура вторичного роста снова вся превращается в Ь-формы бледной трепонеьы с последующей реверсией и появлением третьей волны роста на 90-йдень,С посевом на среду Китта-Тароццидалее поступают так, как описано,т,е, инкубируют в термостате, припоявлении первых признаков роставносят пенициллин, выдерживают 4-7дней в термостате, пересевают наполужидкий агар, инкубируют в термо"стате, при появлении первых признаков видимого роста вносят пенициллин, получают на этом этапе Ь-формы, продолжают инкубировать в термостате до появления вторичного роста, снова делают пересев на средуКитта-Тароцци и т,д, По мере необходимости получают Ь-формы и повторным воздействием пенициллина накультуры вторичного роста с дальнейшим пересевом культур третьей волны роста на среду Китта-Тароцци ит,д.данная культура и ее стРуктуРыпассируют предложенным способом более 30 раз,П р и м е р 2, Культуру Ь-формбледной трепонемы штамма Ставрополь-ми получают воздействием 31 ЕД/млпенициллина и десятикратно пассиру ют на 0,3-ном агаре на основе триптического перевара бычьего сердца с 20 нормальной лошадиной сыворотки, 1,5-2 нормальной сыворотки морской свинки, 0,05 МАЗО и 10 еахароэы с постепенно повышаемыми концентрациями пенициллина от 31 до 500 ЕД/мл. После этого культуру Ь-форм десятого пассажа в количест 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ве 0,3 мл пересевают на среду КиттаТароцци, заливают вазелином, инкубируют в термостате при 37 С. На 4-й день при появлении первых признаков видимого роста в среду вносят пенициллин из расчета 500 ЕД на 1 млсреды, трепонемы в течение 2"5 днейпревращаются в цисты, сферическиеи зернистые формы, Посевы оставляют на хранение при комнатной температуре, Через год при микроскопии посетрипткческого перевара бычьего сердца с 20 нормальной лошадиной сыворотки, 2 нормальной сыворотки морской свинки 0,05 МЯО , 10 сахарозы, Инкубацию проводят в термостате при 37 С, На б-й день появляется рост большого количества очень мелких, еле видимых простым глазом колоний, которые состоят только из Ь-форм, В течение 10-15 .дней колонии увеличиваются в размерах и превращаются в-колония бледной трепонемы, Превращение в Ь-формы происходит при отсутствии Ь-индуцирующегоагента в среде, Как показали контроли, Ь-колонии у пассируемой Ь-культуры бледной трепонемы образуются не спонтанно, а вследствие воздействия пенициллина на культуру передее длительным хранением, Ь-индуцирующее действие пенициллина проявляется через год в субкультуреВпредшествующей культуре на средеКитта-Тароцци Ь-формы под воздействием пенициллина тотчас не образовывались, так как Ь-формы бледной трепонемы на жидкой питательной средене образуются, но воздействие пенициллина таким образом сказалось накультуре, что она при пересеве еечерез год на среду, оптимальную дляобразования Ь-форм, стала расти ввиде Ь-форм, Бледная трепонема превратилась в Ь-формы в результате феномена Ь-постиндукции, т,е, индукции Ь-форм, наступившей спустя длительное время (через год) в культуре поколения, следующего за предшествующим, подвергшимся воздействиюпенициллином в условиях, не оптимальных для превращения бледнойтрепонемы в Ь-формы,Постиндуцированные Ь-формы бледной трепонемы пересеяны на среду Китта-Тароцци с 20 нормальной лоша вов обнаруживают цисты, зерна-гранулы. Культуры пересевают по 0,3 мпв столбик 0,3-ного агара на основе721489 5 формула изобретения Составитель С. МалютинаРедактор Е. Корина Техред И.Асталош Корректор Е. Папп Закаэ 84/23 Тираж 522 . Подписное БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 диной сыворотки, 0,05 МдБОд и 10 сахарозы, среду заливают вазелином и инкубируюг в термостате при 37 фС, На 4"й день появляются первые признаки видимого роста, морфология культуры обычная, В среду добавляют пенициллин из расчета 500 еД/мп среды и посевы инкубируют в гермостате 7 днейНа 7-й день в культуре обна. руживают цисты, зерна, шаровидные элементы. Культуру пересевают на 0,3-ный агар на основе пептона Мартена с. 20 нормальной лошадиной сыворотки, 2 номальной сыворотки морской свинки 005 МБО 10 сахарозы. Посевы инкубируют в термостате при 37 С. На 14-й день появляются первые признаки видимого роста в виде легкого помутнения среды и огдельных колоний, При микроскопии обнаруживают трепонемы и реверсирующие 1 -элементы, В культуру вносят пенициллин из расчета 1000 ЕД/мл среды, В течение 15-20 дней после внесения антибиотика под .микроскопом наблюдают интенсивный процесс Ь"трансформации, в результате которого вся культура превращается в Ь-формы, Ь-формы продолжают инкубировать в термостате при 37 С и на 60-и день после Посева обнаружи вают вторичный рост, обусловленный реверсией Ь-формы, Культуру вторичного роста снова перрсевают на среду Китта-Тароцци с 0,05 МЯО . и10 сахнроэы и далее пассируют, какописано, более 30 раз. 1, Способ культивирования Ь-формЭгеропета рабдцт путем пассирования культур Ь-форм на питательныхсредах в присутствии постепенно воэрастаощих концентраций пенициллинаи инкубированием посевов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюдлительного поддержания культуры вЬ-форме, проводят пассаж на жидкую,питательную среду, после инкубирования пересевают на полужидкую питательную среду, посев инкубируют допоявления вторичного роста культурызатем пересевают на жидкую питатель 20 ную среду, причем пенициллин вводятв питательную среду в каждом пассаже при появлении первых признаковроста.2. Способ пр п. 1, о т л и ч а ю 25 щ и й с я тем, что концентрацию пенициллина от пассажа к пассажу повышают до 4000 ЕД/мп,Источники информации,ЗО принятые во внимание при экспертизе 1. Антибиотики, 11, 1974,с. 998-1003