Способ получения противоопухолевогоантибиотика

О П И-АН И- Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 200178 (21) 2588743/28-13с присоединением заявки йо(51)М. Кл.3 С 12 О 9/14 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 070881 В.И. Фролова, А.Д. Кузовков, М,М. Тайг, Л.П. Иваницкая,С.М Навашин, Т.Г. Терентьева, Б.В. Розынов, В.Е. Гриневи Э.М. Сингал(72) Авторы изобретения Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО АНТИБИОТИКА Изобретение относится к микробио- логической промышленности и касается получения противоопухолевого антибиотика,5Предложенный антибиотик является новым и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.Целью изобретения является получение противоопухолевого антибиотика. Эта цель достигается тем,что штампАсС 1 поаусев соегц 1 евсепз 1072/76Ййращивают на питательной среде,содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевогопродукта.Противоопухолевый антибиотик 1072представляет собой кристаллы желтого 20цвета с температурой плавления 251253 С, в состав которого входят двакомпонента с молекулярным весом482+2 и 4942 (масс-спектрометричесШ25ки),Найдено, Вт С 63,01; 62,91;Н 5,50; 5,65.а) 249,9 х 20 о (с 0,133, в ДМСО),с 315,1+20 о(с 0,011%, .в ледяЭной уксусной кислоте), 30 Антибиотик 1072 растворим в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, пиридине, трудно растворим (при нагревании) в метаноле, этаноле, бутаноле", бензоле, хлороформе, ацетоне, не растворяется в серном и петролейном эфирах, гексане, в воде, разбавленных водных раствораМ кислот, в 10-ном водном растворе едкого натра растворяется медленно с темнофиолетовым окрашиванием.В УФ-спектре антибиотика (в метанольном растворе) наблюдаются мак.симумы поглощения при 245,266,275, 285,393 нм (Е811, 548, 640, 503, 274 соответственно). В ИК-спектре (в КВе- диске) имеются полосы поглощения 3400 см ф (-ОН-группы),1685 см (-С-О-группа), 1620 см (-С=О-группа хинона, связанная водородными связями).Характер УФ-спектра и наличие поглощения в области 1685 и 1620 см в ИК-спектре позволяют предположить, что частью структуры антибиотика 1072 является свободная хиноидная группировка и хиноидная группировка, связанная водородными связями.В ЯМР- спектре силиловых эфиров антибиотика (в СС 1 а) имеются сигП р и м е р 1. Культурой Ас 1.соегц 1 езсецз 1072/76 с агариэованной среды Гаузезасевают колбы Эрленмейра, содержащие 125 мл ФерментационЯ ной среды следующего состава,: глю.коза 11 соя 1; ИаС 1 0,5; СаСО 0,25;РН 7,2-7,4. Инкубируют при 27-28 оС48 ч на поступательной качалке соскоростью вращения 230-250 об/мин. фф Глубинным мицелием засевают партиюколб с той же средой и выращивают96 ч. Полученную культуральную жидкость с активностью 1;1280 ед. Разведения используют для выделения ан- Щ тибиотика 1072.П р и м е р 2. Процесс глубинногобиосинтеза осуществляют по примеру 1на среде состава, 2:глицерин 20, со"евая мука 5, сернокислый аммоний 1,5, Я ИаС 1 3, мел 3. РН 6,8 - 7,0. Активналы четырех метоксильных групп,метильных групп, групп -СНО и четырнадцати ароматических протонов.Противоопухолевая активность антибиотика 1072 1 п что изучалась вопытах на ьишах с перевиваемыми опухолями: асцитными (карцинома Эрлиха,лимфаденоэ Фишера) и плотными (карцинома 755, саркома 180), Способвведения - внутрибрюшинно в двух1режимах: с .1 по 9 день (1 - -+ 9) 9)и на 1,5 и 9 день (1,5,9) после заражения,Противоопухолевая активностьантибиотика 1072, введенного внутрибрюшинно, представлена в табл. 1.Антибиотик 1072, примененный вцвух режимах,вызывал торможение асцитных опухолей на 100; солидных опухолей на 40(саркома 180) и 60(карци"нома 755).Антибиотик 1072 характеризуетсябольшой широтой химиотерапевтического действия: МПД для однократноговведения больше однократной лечебной дозы в 50-250 раз,Антибиотик 1072 активен по отношению к грамположительным бактериям,включая штампы, резистентные к антибиотикам, широко применяемым в медицинской практике (табл. 2).Культурально-морфологическая ифизиологическая характеристика культуры 1072/76Минеральная среда В 1 Гаузе.Воздушный мицелий пушистый илибархатистый, бледно-голубой. Спороносцы спиральные, с 3-5 завитками.Споры шаровидные, овальные с шиповидной оболочкой.Субстратный мицелий бесцветный,среда не окрашена.Крахмальный агар.Рост хороший, воздушный мицелийпушистый, голубой. Субстратный мицелий бесцветный, среда не окрашена.На синтетических средах наблюдаетсяхороший рост, колонии и среды неокрашены.Воздушный мицелий бархатистый,голубой.Овсяный агар.Воздушный мицелий хорошо развит,голубовато-серый, бархатистый, пушистый. Субстратный мицелий бУРый,среду окрашивает в бурый цветСоевая среда.Воздушный мицелий пушистый, слабо развит, голубовато-серого цвета.Субстратный мицелий буроватый, всреду проникает бурый пигмент.Картофельный агар.Воздушный мицелий голубой, Колониив среде бесцветные.Органическая среда В 2 Гаузе.Воздушный мицелий слабо развит, голубоватого цвета. Субстратный мицелий бурый, среду окрашивает в бурыйцвет,Физиологические свойства,Желатину разжимает медленно, молоко свертывает и пептониэирует.Крахмал гидролизует, нитраты восстанавливает, сахарозу инвертирует.На клетчатке не растет. Среда Траснера-Данга чернеет. Ассимилируетглюкозу, маноэу, сахароэу, инозит.Не усваивает рамкозу, сорбит, мальтозу, инулин.Антогонистическое действие в от ношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.Получают антибиотик следующимобразом.Штамм АсФ соегц 1 езсепз 1072/76 1 выращивают на среде, содержащейосновные источники углерода, азотаи минеральные соли. Антибиотик экстрагируют из мицелия органическимрастворителем, экстракт упаривают, 20 из полученного водного остатка антибиотик отделяют Фильтрацией илиизвлекают органическим растворителем. После отгонки получают антибиотик 1072 в смеси с сопутствующимиантибиотиками и неактивными примесями. Отделение от последних осуществляют хроматографированием, а такжекристаллизацией из органических растворителей и их смесей.Для хроматографии (в тонком слое ЗО и колоночной) используют силикагельмарок ЛС 5/40)Ц , Л /40 р , Л 40/100)Ии окись алюминия.Хроматографическая однородностьантибиотика установлена методом тон кослойной хроматографии в системахрастворителей:1. Метанол: СНС 1 . ацетон :2.11:1В 0,6, силикагель ЛС 5/40 р, закрепленнйй слой Фосфатно-цитратный, буфер 40 с РН 7. 2. СНС 1 : метонал;1. В 0,3силикагель Л 5/40 р. 3. Метанол:СЙС 1ацетон в ,2:11:1. В 0,6 (А 11 О),проявление при дневном свете пожелтой окраске, в Уф-свете по желтой Флуоресценции или парами Э .681918 Таблица 1 1,0 1 9 82 60 100 5,0 1-Ф 9 40 100 15,0 1,5,9 100 100 Таблица Минимальная подавляющая концентрацмкг/мл Устойчивость Тест-культура К стрептомицину 1. 81 арЬапгецз 209-р(0,06 0,12 ность культуральной жидкости 1",20 ед. разведения.П р и м е р 3Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде состава, 2 : кукурузный экстракт 10, мел 5, сернокислый аммо" ний 3,5, ИаС 1 5, глюкоза 10, крахмал 15; рН 6,8-7,0. Активность куль" туральной жидкости 1:20 ед. разведения.Н р и м е р 4. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде состава: соевая мука 30, сернокислый аммоний 3, ИаС 1 3, мел 7, крахмал 50, кобальт 0,3 мг/л, рН 6,9 7,0, Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведения.П р и м е р 5. От 4,5 л глубинной культуры, полученной по примеру 1, отделяют мицелнй (фф 0,4 кг). Из мицелия антибиотики извлекают экстракцией 1,2 л ацетона. Экстракт упа- щ ривают в вакууме до д 200 млиз полученного водного остатка антибиотики извлекают этилацетатом, при концентрировании этилацетатного экстракта получают кристаллический осадок в виде желтых или зеленовато- желтых игл, который отделяют и промывают этилацетатом, Вес воздушного сухого осадка 140 мг. После пере- кристаллизации из метанола и высушивания в вакууме при 100 оС получа- Зо ют 85 мг желтых игл с т.пл. 251- 2530 С, (обв 249,9 е (с 0,133, в ДИСО), ЬФ)1) 315,1 в (с 0,011 В в ледяной уксусной кислоте) .Найдено, Ъг С 63, 01; 62,91; Н 5,56; 5,65.В масс-спектре имеются два пика молекулярных ионов 482+2 и 4942,в масс-спектре силиловых эфировмолекулярные пики 7702 и 7822, от-,вечающие молекулярным весам компонентов с четырьмя триметилсилильными группами,П р и м е р 6. Антибиотик экстрагируют из мицелия по примеру 5,экстракт упаривают до водного остатка, из которого антибиотик выпадаетв виде желтого осадка. Осадок отделяют, высушивают (310 мг) и перикристаллизовывают из метанола илисмеси растворителей метанол:СНС 1,:ацетон:11:1, Получают 138 мг антибиотика 1072,П р и м е р 7. Антибиотик экстрагируют из мицелия по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка и антибиотик извлекают этилацетатом, Органическую Фазу упаривают досуха (1,5 г), растворяют в смеси -о)панических растворителей н наносят на силикагель марки Л 40/100 и, высушивают, вносят в колонку с силикагелем, которую сначала промывают хлороФормом,затем элюируют системой метонол:СНС 1.ацетон;11:1.Хроматографически однородные фракции объединяют, упаривают растворитель и кристаллизуют из метанола .Или смеси растворителей. Получают 74 мг антибиотика 1072. Предлагаемый способ обеспечивает получение противоопухолевого антибиотика, обладающего широким спектром противоопухолевого действия, который может найти применение в меди" цине.31,2 9. СапЖйа 500 43 ги 1 езсепз 1072/76 выращивают на питательной среде, содержащей источ-, ники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением й очисткой целевого продукта. формула изобретения Способ получения противоопухолевого антибиотика, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что штамм Ас 1 повусез соеСоставитель С. МалютинаТехред М. Голинка Корректор В, Бутяга Редактор П. Горькова Тираж 528 , Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб., д, 4/5